1 引言

油茶是一种经济、生态和社会效益俱佳的优良树种,其果实功能多样化。炭疽病是油茶最主要的病害,已经严重影响了整个油茶产业的发展^[1]。油茶树感染炭疽病以后,果实、花蕾、叶片会坠落,严重时会有枝梢枯死甚至死亡等症状。感染炭疽病的油茶果树果实含油量会减少一半,炭疽病严重地区的油茶会减产50%以上^[2]。传统的"人种天养,广种薄收"等油茶林管理模式,严重降低了收成,削弱了市场竞争力。目前,急需采用现代新技术管理油茶产业,通过实时获取油茶的生长信息,实现科学生产管理。田间诊断、指示植物和实验室化学分析等传统检测油茶病害的方法耗时、费力,且具有破坏性^[3]。因此需要探索一种快速检测油茶炭疽病的新技术,为防治油茶林炭疽病、提高收益等提供技术保障。

油茶中的Mn元素含量远高于其他植物,被称为“聚锰植物”,油茶的光合作用、呼吸作用、氮代谢^[4]、酶的组成及酶活性调节都与Mn元素息息相关,同时Mn元素也是维持叶绿体所必需的微量元素^[5]。叶绿体中的Mn和蛋白质结合形成酶蛋白,是光合作用不可缺少的参与者。缺Mn时,膜结构会遭到破坏从而导致叶绿体解体,叶绿素含量下降。

因感染炭疽病的油茶冠层光谱特征与其叶片的叶绿素含量具有相关性^[6],本文选取Mn元素作为检测指标,提出了一种快速检测油茶炭疽病的新方法,为油茶炭疽病的防治提供了技术保障。激光诱导击穿光谱(LIBS)^[7]技术是一种结合激光和光谱技术的新型元素检测方法,具有无损、无创、在线多元快速同步检测植物元素等优点。采用LIBS技术对所采集油茶叶片的Mn元素含量进行定量分析检测,分析了用六种不同光谱预处理方法结合偏最小二乘法建立的数学模型,采用波段筛选法寻找最优模型。实现了油茶叶片内Mn元素的快速同步定量检测,解决了油茶炭疽病特异性症状不清、快速诊断机理不明、分析技术精度低等问题。

2 材料与方法

2.1 实验仪器

实验采用海洋光学的LIBS仪器(MX2500+),包含高灵敏度的线阵/面阵CCD检测器、激光能量为100 mJ的Q开关激光器Nd∶YAG,该仪器采集到的光谱数据范围为180~1100 nm,光学分辨率低至0.035 nm。系统的工作原理^[8]:先由Q开关激光器激发高能量脉冲激光通过透镜聚焦在样品表面,经加热、消融、蒸发,焦点处材料的分子和原子相互碰撞,产生等离子体,经光纤传输到8个通道的光谱仪中。然后由检测器完成光电转换,将电信号传输到计算机。最后由配套的操作软件MaxLIBS,对产生的对应元素发射光谱进行分析。MaxLIBS可以控制MX2500+和激光器,还提供了美国国家标准与技术研究院(NIST)的元素光谱库,约有2500条辐射谱线数据,可在软件界面中对光谱进行快速识别分析。

2.2 实验材料

实验样品是从南昌市昌北区秀先路油茶种植区采摘的油茶叶片,分别选取10棵分散的健康油茶果树和新发炭疽病油茶果树,每棵树环绕一周均匀采集形状大小相似的叶片25片,共500片。实验前需用去离子水将叶片表面反复清洗3次,去除叶片表面的尘土,之后晾干、编号装入密封袋保存,样品如图1所示。

图 1. 油茶叶片样本。(a)健康油茶叶片;(b)感染炭疽病油茶叶片

Fig. 1. Sample of camellia oleifera leaves. (a) Healthy camellia oleifera leaves; (b) infected anthracnose camellia oleifera leaves

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为进一步确认视觉划分的正确性,将采集完LIBS光谱数据的油茶叶片进行形态学鉴定和聚合酶链反应(PCR)测试。对比发现,健康叶片的PCR显阴性,无特异性条带产生;染病叶片的PCR显阳性,有特异性条带产生。PCR测试中选核糖体转录间隔区(ITS)作为扩增的基因片段,选真菌转录间隔区(rDNA-ITS)的通用引物ITS1(序列5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(序列5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')^[9]为测试引物。测试结果如图2所示,M为DNA标记,在DNA进行凝胶电泳时起对比作用,M=1表示无样品,即下方无亮带显示;M=2表示染病的油茶叶片,下方对应亮带显示为阳性;M=3表示健康油茶叶片,健康油茶叶片PCR并未出现亮带,显示阴性。

图 2. 油茶叶片PCR测试结果

Fig. 2. PCR test results of camellia oleifera leaves

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PCR扩增DNA片段的结果:测试失败数量52片,其中健康叶片10片,炭疽病叶片42片。将剩余240片健康油茶叶片,208片炭疽病油茶叶片用于后续分析。

2.3 激光诱导击穿光谱采集

光谱采集实验条件:温度为25 ℃左右,相对湿度在80%以下,积分时间为1 s。为了减少因叶片表面不平整和环境因素造成的误差,将叶片叶脉朝上,用双面胶带将叶片平整固定在样品台上。通过移动样品台,采集毎个样本在8个不同位置上的LIBS,取平均值分析每片叶片的光谱,炭疽病油茶叶片的光谱采集均选择在病斑位置附近。

由于原始光谱数据两端包含许多无关紧要的信息,为了降低无效信号对实验结果的干扰,后续只对240~400 nm波段内的光谱数据进行分析,得到的光谱图如图3所示。

图 3. 截取后油茶叶片原始光谱图

Fig. 3. Original spectrum of camellia oleifera leaves after interception

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2.4 火焰原子吸收光谱法测Mn元素含量

为了获取油茶样品中Mn元素的真实浓度,根据国家有关食品安全标准《食品中锰的测定GB5009.242-2017》对样品中Mn元素的真实浓度进行测量。先对油茶叶片进行湿法消解处理,最后利用北京瑞利分析仪器公司的原子吸收分光光度计(WFX-200)在Mn元素最佳条件进行原子吸收试验,测定油茶叶片中Mn元素的真实浓度,最佳测定条件如表1所示。

首先用1 mL的Mn标准溶液与硝酸溶液配置质量浓度分别为0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 mg/L的Mn元素标准溶液。然后利用WFX-200对定容好的标准溶液进行标准曲线的测量,重复测量三次,取平均值作为最终吸光度值。标准工作曲线如图4所示,其中y表示吸光度,C表示Mn元素标准溶液的质量浓度,R为相关系数,可以发现相关系数均高达0.9992以上。通过多次测量得到的相对标准偏差(RSD),验证检测结果的稳定性。RSD与多次测量得到的数据之间的差值有关,即多次测量数据之间的差值越小,RSD就越小,测量结果的稳定性就越好。依次检测所有样品,数据显示样品的RSD基本在5.0000%以下,最低达到0.2564%。因此,可以把原子吸收分光光度计检测到的Mn元素浓度作为样品中Mn元素的真实浓度。

图 4. 标准溶液工作曲线图。 (a)健康油茶叶片;(b)感染炭疽病油茶叶片

Fig. 4. Working curve of standard solution. (a) Healthy camellia oleifera leaves; (b) infected anthracnose camellia oleifera leaves

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2.5 激光诱导击穿光谱预处理方法

实验发现外界的噪声和环境等因素会干扰光谱数据,且LIBS特征光谱信号和干扰信息的光谱信号相互叠加重合,从而降低光谱强度与其对应元素真实浓度之间的相关性^[10]。为了减小误差,用不同的预处理方法对光谱数据进行处理,包括:光谱求平均、S-G平滑(Savitzky-Golay smoothing)、基线校正(Baseline correction)、归一化(Normalization)、一阶求导去噪、二阶求导去噪。

光谱求平均可减弱光谱的噪声信息,提高信噪比。由于LIBS仪器以ms级为单位,如果每个样品只采集一条光谱,实验过程中参数的设置和叶片样品差异都会对结果造成很大的误差。因此对每个样本采集多条光谱数据,取平均值代表该样品的光谱数据。

S-G平滑可以消除光谱采集过程中的噪声信号,提取光谱数据中的有效信息。主要通过多项式对光谱数据进行平滑处理^[11]。平滑点数在平滑处理过程中起至关重要的作用,点数过多容易造成有效光谱信息的丢失,点数过少会导致噪声消除不彻底。

基线校正即背景去除,LIBS光谱的基线变化一般由仪器不稳定、环境变化、样本多样性等多种因素导致^[12]。要保证测量结果在同一标准上,就必须对数据背景进行校正,即将所有变量的光谱值减去最小的光谱值。

归一化算法包括:面积归一化法、平均归一化、最大归一化、矢量归一化^[13]等。实验采用矢量归一化,主要对微小光程引起的差异变化进行校正。

光谱求导不仅可以消除基线干扰、背景干扰,还可以分离重叠的光谱信号,提高光谱分辨率^[14-15]。主要是通过微分转换法将光谱数据转换成新的矩阵,即将每个光谱点的斜率重新连成一条曲线,实验对光谱进行一阶导数和二阶导数。

3 结果与分析

3.1 火焰原子吸收光谱法测量Mn元素

测量得到健康油茶叶片中Mn元素平均值为2.1919 mg/mg,最小值为1.0600 mg/mg,最大值为4.2570 mg/mg。感染炭疽病的油茶叶片中Mn元素平均值为1.4476 mg/mg,最小值为0.7990 mg/mg,最大值为3.3290 mg/mg。可以明显发现感染炭疽病的油茶叶片中Mn元素的平均值、最大值均小于健康油茶叶片,原因是感染炭疽病的油茶叶片表面失绿发黄,叶绿素含量降低。按照3∶1的比例将油茶叶片样品划分为建模集和预测集,将Mn元素的最大真值和最小真值的样品划入建模集,保证建模集中Mn元素含量范围大于预测集。油茶叶片样本中Mn元素含量划分如表2所示,建模集样品共338片,预测集样品共110片。

3.2 油茶叶片激光诱导击穿光谱特征分析

参考美国标准与技术研究院(NIST)中的原子光谱数据库(ASD)和Kurucz数据库中的标准谱线,确定了油茶叶片的LIBS光谱中Mn元素的特征光谱谱线:Mn 279.482 nm、Mn 280.108 nm、Mn II 260.568 nm,如图5所示。

图 5. Mn元素特征谱线位置

Fig. 5. Location of characteristic line of Mn element

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3.3 不同光谱预处理方法油茶叶片Mn元素含量分析模型

对油茶叶片样品的LIBS数据分别进行5点、7点、9点平滑预处理,图6为同一样品的LIBS数据平滑处理前后的光谱图。可以发现,平滑处理能减小噪声信号,突出有用的信息。平滑预处理过程中,窗口的跨度大小直接决定平滑的效果。当跨度较小时,平滑不够,噪声处理不彻底;当跨度过大时,平滑过度,会丢失细节信息。

图 6. 数据平滑处理前后对比

Fig. 6. Comparison before and after data smoothing

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平滑处理虽然减少了外界随机噪声,但LIBS数据中仍然存在大量的基线漂移、样品表面差异等噪声,影响了光谱数据与叶片中Mn元素含量的相关性,也影响了定量模型的准确性和稳定性。在此基础上,实验将平滑处理后的数据分别进行去噪、归一化、基线校正、一阶求导降噪、二阶求导降噪预处理,建立了偏最小二乘法(PLS)模型,模型参数如表3所示。其中R_C为建模相关系数,RMSECV为建模均方根误差,R_P为预测相关系数,RMSEP为预测均方根误差。

从表3中可以发现,不同预处理方法处理平滑后数据的模型,不仅减少了光谱的随机噪声,还提高了模型的精度,即相关系数R_C。与原始模型相比,经归一化和基线校正处理后的模型预测效果略有下降,而经过去噪、一阶导数、二阶导数预处理后的模型效果均有不同程度的改善。结果表明:基于LIBS技术,结合7点平滑和一阶导数预处理方法,建立的PLS模型是最优的,可以实现对油茶叶片中Mn元素的定量分析,结合7点平滑和一阶导数预处理方法,得到的建模和预测模型散点图如图7所示。

图 7. Mn元素7点数据平滑和一阶导数去噪处理的PLS模型和预测模型。(a) PLS模型;(b)预测模型

Fig. 7. PLS model and prediction model of Mn element after 7-point data smoothing and first derivative de-noising. (a) PLS model; (b)prediction model

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3.4 间隔偏最小二乘法波段筛选分析

由于光谱预处理方法不能完全去除光谱数据中的无用信息,间隔偏最小二乘法(iPLS)是一种波段筛选方法,可有效去除不相关变量,提高模型的精度和预测能力。用iPLS对PLS建模前的LIBS光谱数据进行波段筛选。将240~400 nm波段范围内的光谱数据进行7点平滑、一阶求导去噪预处理后,划分为1~30个等宽子区间,然后分别对每一个子区间建立PLS模型,得到的465个局部PLS回归模型如表4所示。

由表4可知,在等宽子区间中,区间数为24的第6个子区间的IPLS模型的RMSECV最小、相关系数R最大,分别为0.2090、0.9076,即iPLS模型效果最佳,因此选择区间数为24的第6个子区间的光谱数据建立定量模型。

图8(a)为含有RMSECV的第24个区间的光谱图,图中虚线表示全光谱数据建模得到的RMSECV,矩形高度表示各子区间的RMSECV。可以发现第6个子区间所建模型的RMSECV远小于全光谱建模的RMSECV,故第6个子区间为最佳子区间,且该区间的最佳主成分因子数为8。图8(b)中的阴影部分为第6个子区间在整个光谱中对应的位置,波长范围为247.91~281.315 nm,包含Mn II 260.568 nm、Mn 279.482 nm和Mn 280.108 nm光谱。

图 8. iPLS模型选择的最佳子区间。(a)含有RMSECV的第24个区间的光谱图;(b)第6个子区间对应的光谱图

Fig. 8. Best sub-interval selected by the iPLS model. (a) Spectral graph of the 24th interval with RMSECV; (b) spectral graph corresponding to the 6th sub-interval

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图 9. iPLS建模集散点图

Fig. 9. iPLS modeling set scatter diagram

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采用iPLS筛选的最佳子区间对应波长范围内的光谱数据建立定量模型,Mn元素浓度的真实值与预测值的建模模型结果如图9所示,可以发现R_C为0.9076,RMSECV为0.2090 μg/mg;Mn元素浓度的真实值与预测值的预测模型结果如图10所示,R_P为0.8947,RMSEP为0.2100 μg/mg。iPLS模型与全波段PLS最优模型结果相差不大,但iPLS模型效果更好。

图 10. iPLS预测集散点图

Fig. 10. iPLS prediction set scatter diagram

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4 结论

采用火焰原子吸收光谱法对样品中的Mn元素真实含量进行了分析,根据待测元素的特征谱线选定规则,确定了油茶叶片的LIBS光谱中Mn元素的特征分析谱线:Mn 279.482 nm、Mn 280.108 nm和Mn II 260.568 nm。通过比较不同的光谱预处理方法对LIBS光谱数据预处理的结果,发现7点平滑结合一阶导数去噪预处理后模型效果最好,R_C为0.9025,RMSECV为0.2192 μg/mg,R_P为0.8882,RMSEP为0.2356 μg/mg。iPLS波段筛选结果表明,划分成24个等宽子区间中的第6个子区间为最佳子区间,该区间的RMSECV最小,为0.2090 μg/mg,R_C和R_P分别为0.9076和0.8947。结果表明,应用LIBS技术结合化学计量学方法检测两类油茶叶片内的Mn元素具有一定的可行性,为油茶炭疽病检测提供理论依据。