基于SERS光谱技术的滑膜型关节炎研究 
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1 引言
关节炎一般是指在人体关节及其周围组织中,由于创伤、感染、炎症、退化或其他一些因素产生的疾病[1]。目前全世界大概有3.55亿关节炎患者,中国大约有一亿以上的关节炎患者,比例高达28.2％[2]。据了解,目前对滑膜型关节炎的诊断采用的检测方法有核磁共振、关节穿刺抽液检查、超声显像[3]、X射线[4]、计算机断层扫描[5]。但这些传统检测方法往往存在着对人体伤害大、效率低、需要多种方法结合起来检查等缺点。因此,急需一种快速、无损或轻微创伤的方法进行诊断。
拉曼光谱技术[6-7]以其巨大的临床应用潜力,引起了人们极大的研究兴趣。基于非弹性光散射的拉曼光谱技术是一种无创、灵敏的光学分析技术。每个分子有属于自己的振动、转动方式,因此分子可以提供蛋白质、核酸和脂类等大分子的重要生化信息[8]。但是测量得到的拉曼光谱存在两个主要缺点：一是拉曼散射信号本身非常微弱。通常只有106~108个光子与样品相互作用时才能发生非弹性拉曼散射,因此就需要使用强激光功率或长时间收集数据来获取光谱,这样造成的结果就是损害生物样本。二是自荧光的干扰。生物样本的拉曼光谱经常与强烈的荧光背景相叠加,这使得获取拉曼信号变得比较困难[9]。这两个缺点使得常规拉曼光谱在医学诊断中的应用面临巨大挑战。
基于纳米技术的表面增强拉曼光谱（SERS）[10-11]可以克服传统拉曼光谱技术的缺点,目前已被应用于许多分析系统中。SERS技术具有无损伤、超灵敏的优点,它可应用的领域很广泛,从生物大分子（如氨基酸、蛋白质和DNA/RNA）到细胞或组织等复杂生物样品中都有涉及[12]。当探测分子与金或银纳米粒子接近时,自荧光背景就会降低,而相对弱的拉曼信号则可大大增强。所查资料显示,目前还没有利用SERS光谱对关节液进行检测的相关报道。鉴于此,本文主要采用SERS技术对关节液进行检测,以验证SERS技术无损、快速、灵敏地诊断关节炎的可行性。
2 材料与方法
2.1 银胶与关节液样本的制备
本文主要根据Leopold和Lendl提出的脱氧法制备银胶,主要包括以下几个步骤：
1） 将0.017 g硝酸银溶于90 mL蒸馏水中,配制出1.1×10-3 mol/L的硝酸银溶液;
2） 将0.42 g盐酸羟胺溶于100 mL蒸馏水中,配制成6×10-2 mol/L的盐酸羟胺溶液;
3） 将0.4 g氢氧化钠溶于100 mL蒸馏水中,配制成0.1 mol/L的氢氧化钠溶液;
4） 将4.5 mL氢氧化钠溶液倒入5 mL盐酸羟胺溶液中,然后将混合物快速加入到90 mL的硝酸银溶液中,一直振荡直到溶液呈现乳灰色,此溶液即为银胶溶液;
5） 以10000 r/min的速度对银胶溶液进行离心处理,时间为10 min,然后除去部分上清液,取底部的浓缩液与关节液样本混合后进行SERS测量。该关节液样本采集于厦门大学附属福州第二医院,并且已获得该机构伦理委员会的批准。关节液样本包括18例病患的关节液样本和15例健康人的关节液样本。将所取得的关节液以2000 r/min的速度离心5 min,然后取上清液进行实验。
2.2 SERS的测量
将制备好的关节液与银胶以体积比为1∶1的比例混合,滴在长方形铝板上进行SERS测量。本实验使用共聚焦拉曼显微光谱仪在785 nm二极管激光激发下测量SERS光谱,波数范围为400~1800 cm-1。使用Peltier冷却电荷耦合器件（CCD）相机在10 s积分时间内以20倍的物镜和2 cm-1的分辨率记录拉曼散射光。硅晶片的520 cm-1振动峰用于频率的校准;采用软件包WIRE 2.0进行光谱的采集和分析。
2.3 数据的处理与分析
SERS光谱分析主要分为以下几个步骤：
1） 扣除荧光。因为初始光谱是由SERS信号和自发荧光背景信号组成的[13]。
2） 归一化。目的是减小激光功率波动产生的光谱强度变化的影响以及更好地比较峰值强度和光谱形状[14-15]。
3） 采用Origin软件进行平均谱和差谱的绘制。
4） 采用PCA-LDA方法对归一化数据进行处理。主成分分析（PCA）用于确定一组新的正交变量（该变量能够反映不同组之间的差异）,而线性判别分析（LDA）就是采用交叉验证的方法识别每一组的区别[16-18]。
5） 采用接收操作特征（ROC）曲线评估PCA-LDA方法的性能。
3 结果与讨论
3.1 关节液SERS光谱分析
为了降低不同光谱强度的差异以及更好地对比分析光谱的形状,将所测得的SERS光谱数据扣除荧光背景后进行归一化处理,得到400~1800 cm-1范围内光谱曲线下的积分面积。由
表 1. SERS峰位置对应的主要成分[19-27]
Table 1. Raman peak positions and tentative assignments[19-27]
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图 1. 病患关节液(n=18)和健康人关节液(n=15)的平均SERS光谱与差谱图
Fig. 1. SERS average spectra and different spectra of joint fluid from arthritis patients(n=18) and normal people(n=15)
3.2 PCA-LDA分析
为了检验SERS光谱区分健康人与关节炎病患的能力,本文采用PCA-LDA[28-30]方法对所获得的光谱数据进行分析。本文首先采用PCA-LDA方法分析关节炎病患和正常人的关节液,然后采用SPSS软件进行精细处理,得到光谱主成分得分（PCs）,根据主成分得分选出具有显著差异的主成分（最好是p<0.05）,对其进行t检验。分析得出具有显著差异的3个主成分（即PC1、PC2和PC3）后,绘制三维图谱。
图 2. 后验概率与ROC曲线。(a)基于PCA-LDA分析,采用交叉验证方法得出的关节炎病患与健康人关节液样本SERS光谱的后验概率散点;(b)不同鉴别阈值下的ROC曲线
Fig. 2. Posterior probability and ROC curves.(a) Posterior probability scatter of SERS spectra of joint fluid from arthritis patients and normal people based on PCA-LDA analysis and cross-validation method; (b) ROC curves under different identification thresholds
为了更直观地观察PCA-LDA诊断模型的最佳效果,本文分别以三个主成分PC1、PC2、PC3为坐标轴,绘制了三维散点图,如
图 3. 基于PCA-LDA分析,采用交叉验证方法得出的关节炎病患(圆点)与健康人(五角星)关节液样本SERS光谱的三维散点图
Fig. 3. Three-dimensional scatter plot of SERS spectra of joint fluid from arthritis patients (dot) and normal people (pentagram) based on PCA-LDA analysis and cross-validation method
4 结论
本文主要基于银纳米材料与SERS拉曼光谱的结合,采用PCA-LDA方法对关节炎病患（n=18）和健康人（n=15）的关节液样本进行了检测与分析。比较两者的差谱可以发现,关节炎患者关节液中的多糖、DNA、δ（CH2）、鸟嘌呤、酰胺I带高于健康人,而糖原、磷脂酰肌醇、蛋白酪氨酸、葡萄糖、蛋白酰胺吸收则低于健康人。结合PCA-LDA与ROC的分析方法的诊断灵敏度可以达到80%,特异性可以达到83.3%,说明该技术能够快速高效地检测和区分关节炎疾病。
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董弦虎, 汤淑珍, 陈孙裕, 许建树, 林雅敏, 高思琪, 钟浩然, 林婷婷, 高佳敏. 基于SERS光谱技术的滑膜型关节炎研究[J]. 激光与光电子学进展, 2021, 58(1): 0117001. Dong Xianhu, Tang Shuzhen, Chen Sunyu, Xu Jianshu, Lin Yamin, Gao Siqi, Zhong Haoran, Lin Tingting, Gao Jiamin. Study on Synovial Arthritis Based on Surface-Enhanced Raman Scattering Spectroscopy[J]. Laser & Optoelectronics Progress, 2021, 58(1): 0117001.
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