1 湖南省畜牧兽医研究所, 长沙 410128
2 湖南农业大学动物医学院, 长沙 410128
为建立一种能够快速检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的普通PCR方法, 本研究分别以ASFV B646L和F778R基因为靶序列设计了两对特异性引物, 建立ASFV B646L和F778R双基因普通PCR方法, 并对其特异性、灵敏性及重复性进行检测。结果显示: 该PCR体系(25.0 μL体系)的最优组合为Pfu酶0.2 μL、10×Reaction Buffer 2.5 μL、2.5?mmol/L dNTP Mixture 2.5 μL、B646L上下游引物各1.5 μL、F778R上下游引物各0.5 μL、DNA模板1.0 μL; 退火温度为57℃、退火时间为30 s、72℃延伸2.5 min, 30个循环。该方法仅针对ASFV B646L和F778R基因进行特异性扩增, 无交叉反应。同时对B646L和F778R阳性质粒的最低检测下限分别为7.2×107 copies/μL、1.5×106 copies/μL, 试验重复性良好。本研究对于提高ASFV临床诊断的准确性、特异性和高效性具有重要价值, 为其快速检测提供了可靠的技术支撑。
非洲猪瘟病毒 多重PCR B646L基因 F778R基因 快速检测 African swine fever multiplex PCR B646L gene F778R gene quick detection
1 湖南省兽药饲料监察所, 长沙 410006
2 湖南农业大学动物医学院, 长沙 410128湖南省兽药工程技术研究中心, 长沙 410128
3 湖南农业大学动物医学院, 长沙 410128
血管生成素 4(ANG4)是一种新型抗菌肽蛋白, 具有抗菌、抗炎、血管生成、调节机体免疫反应等多种生物学功能, 在机体先天免疫过程中发挥重要的作用。 ANG4在新生小鼠肠道的表达受到多种因素的调节, 如细菌信号和发育过程等。本试验选取细菌细胞壁表面分子的类似物壳寡糖( COS)作为诱导物, 探究其对小鼠肠道 ANG4表达和对肠道形态的影响。实时荧光定量聚合酶链式反应( qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹( Western blot)分析表明, COS能增加小鼠肠道 ANG4 mRNA及 ANG4蛋白的表达；形态学观察结果显示, COS使小肠绒毛高度明显增加, 平均隐窝深度均有降低, V/C值增加, 表明 COS可通过诱导 ANG4等抗菌蛋白的表达, 或通过其杀菌和免疫调节作用而不同程度地提高小肠黏膜的完整性。研究结果为 COS以及 ANG4在仔猪肠道疾病防治的应用提供了理
抗菌蛋白 实时荧光定量 PCR 蛋白质免疫印迹 ANG4 ANG4 COS COS AMPs qRT-PCR Western blot
1 上海理工大学 光电信息与计算机学院, 上海 200093
2 上海理工大学 上海市现代光学系统重点实验室, 上海 200093
数字PCR（dPCR）技术作为传统PCR技术的更新迭代, 有着绝对定量的特点, 在新冠病毒核酸序列检测、癌细胞探测等生物学领域有着巨大的潜力。现有的dPCR荧光检测系统在检测通量、检测速度以及成本之间难以做出合理的权衡。由于成像视野小、需多次图像拼接极大影响了dPCR荧光检测系统效率和时间。文章构建了一套采用大视场荧光显微设计的多通道dPCR检测系统实验平台, 依托该实验平台, 运用Zemax软件优化结构, 改进显微成像物镜设计, 能够实现直径18mm的全视场范围FAM、HEX、ROX三种荧光通道分辨率在6μm的多通道成像。采用随机霍夫变换算法(RHT)图像处理分析方法, 对常规均匀“圆孔”和新型“雪花”、“树枝”等非均匀结构的微流控荧光芯片, 均能实现高效检测, 得到清晰、稳定的荧光图像。
应用光学 数字PCR 光学设计 荧光显微镜 微流控芯片 applied optics digital pcr technology optical design fluorescence microscope microfluidic chip
1 湖南师范大学心脏发育研究中心, 长沙 410081
2 莱州市妇幼保健院, 烟台 261400
甲醛溶液浸泡的人类组织样本很多情况下是可遇不可求的珍贵资源, 而其 DNA 的提取是一大难题。本文分别使用改进的甲醛溶液浸泡样本基因组DNA提取方法以及通用型基因组DNA提取试剂盒, 对四份不同时间固定的福尔马林浸泡的人类胚胎皮肤和肌肉的样本进行基因组DNA提取。使用紫外分光光度计鉴定所提取DNA的纯度和质量浓度, DNA溶液点样进行琼脂糖凝胶电泳及成像, 结果显示, 改进的提取方法所得基因组DNA的质量浓度和纯度均优于通用型基因组DNA提取方法。以提取所得的基因组DNA模板进行PCR扩增, 电泳结果显示, 改进的提取方法所提取的基因组DNA有更好的PCR扩增效果。本研究为甲醛溶液浸泡的珍贵样本的基因组DNA的提取提供了方法指导和改进方向的参考。
甲醛浸泡 人类组织样本 DNA提取 PCR检测 琼脂糖凝胶电泳 formaldehyde immersion human tissue samples DNA extraction PCR detection agarose gel electrophoresis
1 河北工业大学 机械工程学院，天津30040
2 河北省智能传感与人机融合重点实验室，天津300130
3 电工装备可靠性与智能化国家重点实验室，天津0012
4 河北工业大学 生物物理研究所，天津30001
针对数字液滴聚合酶链式反应（droplet digital Polymerase Chain Reaction， ddPCR）核酸检测中数字聚合酶链式反应由液滴数量多、尺寸小、排列紧密、荧光强度不均匀而导致的液滴难以计数问题，提出一种图像处理方法，基于灰度遍历法采集图像的信息，通过微分分析法对液滴进行分类和计数，可准确采集ddPCR实验的图像信息。通过卷积算法去除图像中的噪声，使用灰度分布均衡化法增强图像的对比度。以灰度遍历的方式将图像在逐个阈值下二值化，并以几何条件为限制统计液滴数量。通过微分分析法对数据进行分析，得出荧光液滴与全部液滴的计数结果。在以人类gDNA（genomic DNA）为检测样本的ddPCR实验中，该算法的平均检测准确率为99.36%，与商用仪器算法和同类算法相比分别提高了2.24%，2.53%。该方法为ddPCR实验提供了可靠的检测结果，可更好地适用于ddPCR实验。
荧光斑点检测 数字液滴PCR 核酸检测 图像处理 图像分析 fluorescent spot detection droplet digital PCR nucleic acid detection image processing image analysis
1 山西农业大学农学院, 太谷 030801
2 省部共建有机旱作农业国家重点实验室(筹), 太原 030031
叶绿素酶(CLH)是植物叶绿素降解过程中的关键酶, 在植物生长发育过程中发挥着重要作用。为了解小麦CLH基因家族成员在叶绿素降解过程中的功能差异, 本试验采用生物信息学分析方法和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对小麦CLH基因家族进行鉴定和初步功能分析, 结果表明: 小麦中共鉴定到13个CLH成员(TaCLH1～TaCLH13), 分布在3A、3B、3D、4B、5A、5D、6A、6B和6D染色体上; 其中13个家族成员的启动子中均含有植物激素响应元件、环境胁迫响应元件和植物生长发育响应元件; 分析TaCLHs在不同组织和不同发育阶段中的表达模式发现, 大部分成员在叶/嫩枝和穗中有表达; 结合qRT-PCR分析发现, TaCLHs在不同的生长发育阶段参与叶绿素降解过程。这些研究结果都为后续研究相关基因的功能奠定了基础。
小麦 CLH基因家族 叶绿素降解 表达分析 wheat CLH gene family chlorophyll degradation expression analysis qRT-PCR qRT-PCR
1 中国科学技术大学，安徽合肥230026
2 中国科学院 苏州生物医学工程技术研究所 国科学院生物医学检验技术重点实验室，江苏苏州15163
3 苏州大学 电子信息学院，江苏苏州215006
4 复旦大学 儿科医院，上海201102
5 季华实验室，广东佛山28200
传统的数字PCR检测仅针对扩增终点的核酸样本执行终点式的荧光分析，依据反应后的荧光图像进行阴阳性统计及样本浓度计算，分析结果极易受假阳性及非特异性扩增影响。本文提出了一种基于过程的实时微孔式数字PCR芯片阴阳性分析方法，从时间维度对数字PCR结果进行定量分析，提高数字PCR检测的准确性。设计支持实时数字PCR分析的硬件系统并与终点式数字PCR仪进行对比，验证系统性能。在此系统上检测不同浓度的人类Ⅳ型疱疹病毒样本，获取实时扩增曲线，采用支持向量机算法对扩增曲线的特征进行学习并应用于检测曲线分类。实验结果表明，所设计的实时数字PCR系统与终点式数字PCR仪扩增结果具有高度一致性。本文所述的基于支持向量机的分类算法对扩增曲线的分类准确率达到98%以上，能准确识别假阳性及非特异性扩增微孔。相比于传统阈值分割法，本方法对阳性点识别的平均准确率提高了17.60%，并且目标模板拷贝数越低，效果越明显。与传统的终点式数字PCR相比，本文提出的基于实时数字PCR系统的数据分析方法具有准确性更高的优势，尤其在低拷贝数检测下可以获取更为精确的定量结果。
实时数字PCR 阴阳性分类 支持向量机 定量准确性 real-time digital pcr negative and positive classification support vector machine quantitative accuracy
1 上海理工大学 光电信息与计算机学院, 上海 200093
2 上海理工大学 上海市现代光学系统重点实验室, 上海 200093
3 上海理工大学 出版印刷与艺术设计学院, 上海 200093
数字聚合酶链式反应(dPCR）作为一种新的核酸检测技术, 在生物医学等领域得到广泛的应用。为了进一步提升现有的dPCR检测系统的检测效率, 设计了一套基于大视场荧光显微镜的dPCR检测系统, 将照明系统与滤波模组设计于显微镜物空间, 结合复眼照明系统实现大面积匀光照明, 照明面积可达到32mm×22mm, 照明均匀性达到80%以上, 提出一种结合神经网络的培养皿计数检测方法, 可以有效筛选出培养皿中已经蒸发的培养皿。整个系统从相机曝光到检测结束仅需要几秒钟时间, 相比传统的图像拼接式检测方法, 其检测效率得到了明显提高。
数字PCR 照明设计 荧光显微镜 图像处理 digital PCR illumination design fluorescence microscope image processing
为了快速准确地鉴定出 3种不同的马铃薯(Solanum tuberosum L.)病原菌，即致病疫霉(Phytophthora infestans)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和茄链格孢菌(Alternaria solani)，根据 GenBank中的这 3种病原菌基因序列设计特异引物，从影响多重聚合酶链式反应(PCR)扩增的因素(如退火温度和引物浓度)对反应体系进行优化，建立能够同时检测 3种马铃薯病原菌的多重 PCR方法。结果显示，所建多重 PCR方法的检测限为 40.0 fg/μL，灵敏度较高，且具有良好的特异性。该检测方法实现了同时对 3种马铃薯病原菌的高效、快速的检测，提高了检测效率，降低了检测成本，在马铃薯病害的早期预防、诊断及防控中具有较高的应用潜力。
马铃薯病原菌 致病疫霉 立枯丝核菌 茄链格孢菌 多重 PCR检测方法 potato pathogen Phytophthora infestans Rhizoctonia solani Alternaria solani multiplex PCR assay
1 上海大学通信与信息工程学院, 上海 200444
2 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所中国科学院生物医学检验技术重点实验室, 江苏苏州 215163
3 中国科学技术大学, 安徽合肥 230026
蜂窝状堆叠数字 PCR微阵列图像因其单元尺寸小、排列密集, 荧光信号弱、易受光照分布影响, 其样点定位困难。本文提出基于形态学的三通道蜂窝状荧光图像样点寻址算法及数字 PCR图像信息提取方法, 可快速、有效识别微阵列芯片生物分子微弱荧光信息。针对不同通道的图像进行配准融合, 使样点排布整齐;通过增强图像的对比度, 选取有效样点区域, 基于改进伽马算法去除光照分布不均效应;基于形态学算法识别紧密排列的样点, 对微阵列芯片图像进行单元分割定位, 提取每个样点的生物分子荧光信息。该方法处理一块约 20 000个微单元的数字 PCR芯片图像的耗时小于 20 s, 与现有定位方法相比, 处理相同数量样点的图片的耗时可减少 3个数量级;通过与标准仪器结果相比, 样点识别精度达到 98. 79%, 生物信息计算结果(拷贝数)准确度达到 96. 2%。本文提出基于形态学的三通道蜂窝状荧光图像样点寻址算法及数字 PCR图像信息提取方法克服了蜂窝状堆叠式微阵列荧光图像样点难以定位的问题, 与现有方法相比, 能够快速、准确地获取生物信息, 为数字 PCR技术的精准定量奠定了基础。
生物荧光图像 蜂窝状 数字 PCR微阵列 寻址定位 bioluminescent image honeycomb digital polymerase chain reaction microarray spot addressing 光学 精密工程
2020, 28(12): 2745
