突破衍射极限,光学移频超分辨成像技术


 

40周年约稿| 郝翔, 杨青, 匡翠方, 刘旭 . 光学移频超分辨成像技术进展 [J]. 光学学报, 2021, 41(1): 0111001.

微信链接:

编者按

光学移频超分辨成像不拘泥于荧光非线性效应的限制,兼具非荧光标记样品以及荧光标记样品的超分辨成像能力,在材料学、生物学和医学等领域展现了很好的应用前景。《光学学报》创刊40周年之际,编辑部特邀浙江大学刘旭教授课题组撰写《光学移频超分辨成像技术进展》综述论文。本文将从原理和方法上详细综述移频超分辨光学显微成像技术,并对未来发展方向进行了评述和展望。

1、背景介绍

在历史的长河中,利用相应设备对目标样品进行成像一直是人类感知外界并获取信息最为重要的手段。

相比其他波段的成像仪器,光学成像系统由于其成像速度快、对样品无损、操作方便、可进行三维成像以及可实现特异性结构区分等优点,在材料、生物与医学成像等领域具有广泛的应用。


图1 超分辨成像在材料,光刻、生物,医学领域的应用(图片来自网络)

然而,由于衍射现象的存在,光学成像系统普遍存在分辨率受限的问题——这一问题在人类观察微观世界时显得尤为突出,并一度成为困扰人类科技进步的桎梏。

在可见光波段,普通光学显微镜的横向和轴向分辨率局限在200-250 nm以及500-600 nm范围。与此同时,随着物理学、材料学、生物学、医学以及生命科学等领域的飞速发展,人们对显微镜的分辨率提出了更高的要求,如何实现亚百纳米甚至更小的分子水平的观测成了科学家们的迫切需求。因此,探索基于可见光波段的可以突破衍射极限、提高成像分辨率的显微技术成为当务之急。

受到合成孔径技术的启发,光学移频超分辨成像技术的核心思路就是通过一些调制技术将传统光学显微镜无法获取到的样品高频分量移动到系统的低通频带范围内,随后通过频谱解调,实现实际频谱接收范围的有效扩展。光学移频超分辨成像技术一般具有以下优点:

1)对样品制备要求较低,无需荧光标记要求,因此样品普适性更高;

2)所需照明光强较低,因此对样品的光漂白和光损失更小,更适用于长时程成像;

3)可应用于宽场成像的场合,成像速度快,因此更适用于快速活细胞成像。

2、光学移频超分辨成像技术

目前,光学移频超分辨成像技术根据光波场的波矢大小主要分为传导场移频超分辨成像技术和倏逝场移频超分辨成像技术两大类。

2.1 传导场移频超分辨成像技术

目前典型的传导场移频超分辨成像技术主要有合成孔径显微成像技术、结构光照明显微成像技术、探测器端移频超分辨成像技术等。

浙江大学刘旭教授课题组提出的非线性焦斑调制显微技术(NFOMM,如图2所示),通过高强度照明带来的荧光激发的非线性效应来扩展系统的有效空间频率带宽,再采用空间光调制器在激发光路进行相位调制产生PSF空间频率的重新分配从而保留来自物体的高频分量。样品的高频信息在一个或多个激发光斑的相位调制下被移回系统的频率通带后,就可以利用多视图反卷积算法进行后处理,以重建超分辨对象。其基本原理如图 2所示。


图 2 NFOMM工作原理

类似的方法还包括刘旭教授课题组提出的多焦点饱和虚拟调制技术,利用荧光饱和激发的非线性效应以及多焦斑照明技术分别提高了空间分辨率和时间分辨率(如图3所示)。


图 3 多焦点饱和虚拟调制技术原理图

由刘旭教授课题组提出的虚拟k空间调制光学显微技术(VIKMOM)同样是通过对探测端的数字图像进行虚拟调制以获得高频信息,不过其在将探测器阵列采集到的图像转换为SIM数据后,是采用改进的傅里叶叠层成像算法而不是传统的SIM移频算法来恢复出超分辨图像,因此对噪声不敏感,且能校正未知光学像差。其成像过程如图4所示。


图4 VIKMOM示意图及其用于超分辨率图像恢复的解码过程。(a)成像系统原理; (b)用于超分辨率图像恢复的解码程序流程图

2.2、倏逝场光学移频超分辨成像技术

横向波矢越大,移频量就越多,可被远场探测到的空间频率就越高,对应的成像分辨率也会越高。经典的光学移频超分辨成像技术使用传导场,即要求‖K_z ‖为实数。因此,对应的截止频率上限受到了限制。为了提高系统分辨率,需要更大的‖K_ill ‖,最终‖K_z ‖会成为虚数,整个移频场因此成为倏逝场。根据倏逝波的性质,可以分为介质材料全反射产生的倏逝波和金属介质界面产生的表面等离激元(SPP)。

刘旭教授课题组使用棱镜(包括直角棱镜与道威棱镜)的全内反射界面实现了表面倏逝波照明(如图5所示)。由于在发生全内反射的光束覆盖范围内,均可实现倏逝波照明,相比于之前基于一维微纳光纤的倏逝波照明的设计,大大提高了成像视场。然而,这种基于棱镜的设计仍然难以方便地改变照明方向,满足二维移频成像的需求。另一方面倏逝波的横向波矢受限于全反射角,而且背景噪声难以过滤,所以只实现了λ⁄2.5的分辨率。


图 5 倏逝波移频超分辨显微方法装置图

2017年,针对全内反射所形成的倏逝场光波矢受限的问题,刘旭教授课题组进一步改进了设计,首次使用纳米线配合高折射率薄膜的方法,在扩大视场的同时,提高了图像对比度,实现了122 nm的横向分辨率。

上述几种方法虽然验证了倏逝场实现光学移频超分辨成像的基本原理,但是均存在难以调整倏逝场方向、进而较难实现全向超分辨的问题。针对上述难题,该课题组提出了一种采用倏逝波进行照明实现大频带移频的超分辨显微方法,称为环形纳米线照明显微镜(NWRIM,如图6所示)。


图6 NWRIM基于原理。(a)NWRIM基本结构与成像示意图;(b)多种二维亚衍射结构NWRIM超分辨显微成像结果

基于该理论模型,刘旭教授课题组随后还进一步研究了波导型倏逝场移频超分辨成像中偏振效应,发现了波导表面倏逝场照明超分辨成像中的偏振选择性,利用该特性,实现了对成像系统背景噪声的有效抑制,图像的信噪比提升了4倍以上。

2019年,该课题组在原有的基础上进行了提升,将有机发光薄膜代替纳米线作为倏逝场发光光源,应用于片上超分辨显微成像。有机发光薄膜具有可见光宽频谱范围的发光特性,结合滤光片采集即可实现宽频谱范围的移频。同时有机发光薄膜制备工艺简单、成熟,具备大规模加工的优势。结合频谱合成算法,该课题组首次实现了140nm的分辨率和复杂样品的重构。并以此为基础,研制了各种光学移频超分辨成像芯片,实现了片上无标记移频超分辨成像的实用化。

除了直接使用倏逝场直接进行照明实现光学移频超分辨成像之外,也可以利用光与物质的相互作用,利用传导光激发具有大光波矢的局域场来实现类似的作用。在这一方面,目前研究最为深入的便是利用表面等离子激元(SPP)实现结构光照明。目前已经有采用边缘/刻槽的激发方式, 用以激发相对传播的表面等离激元来产生结构光照明样品,实现了120 nm左右的超分辨。表面等离子激元中普遍存在着的有效折射率和传输距离之间的矛盾,因此必须在有效视场与分辨率之间进行取舍。

除了采用传播的SPPs干涉作为结构照明光,我们还可以利用周期分布的局域等离激元(LPs)来进行更大范围的移频。局域等离激元照明图案可以由电子束刻蚀制备的等离激元天线阵列产生。目前,LP-SIM成功地实现了在低激发光强(100-150 W/cm2)下的视频级速度(30-40 Hz)的超分辨成像,其分辨率可以达到50 nm。

利用SPP或LP-SIM可以产生极高频率的表面波,因此可以获得相关频段的高分辨成像。但是应该指出的是,当这些频率远高于显微物镜的截止频率kobj,也就是SPP的频率大于约1.6倍成像光波矢时,移频成像的结果就会出现低频域中间频段的缺失,如图7所示。


图7 SPP移频步长过大导致的频谱分量分量缺失现象

对于极高SPP移频成像,要获得完整的样品图像超宽频谱的成像信息,不仅要移频,还需要拓宽成像的空间频谱,这就是需要扩频,将中间缺失的频段的信息补全。所以基于频带拓宽的移频成像,是解决理论上移频不存在成像分辨率缺陷的关键,也是当前需要研究的方向。

3、总结与展望

相比于其他超分辨方法,光学移频超分辨成像技术的最大优势在于所需照明光强低,可以宽场成像、成像速度快,因此在活细胞成像领域具有更大的应用前景,而其中的SIM移频技术更是在目前所有超分辨光学显微成像技术中保有最快的成像速度记录。

光学移频超分辨成像技术的进一步发展主要集中在两个方面。第一点是集中在技术本身的发展,包括系统和算法优化两个方面。第二点则是与其他技术的有机结合,实现优缺互补,从而大大提升单一技术的应用领域。总之,我们相信,随着上述各方面的发展,光学移频超分辨成像系列技术的应用潜力将被进一步挖掘,并更好地助力前沿科学,特别是生物学、医学和材料学相关科学问题的研究。

 

课题组简介:

浙江大学刘旭教授领衔的研究团队目前有教师10余人、研究生100余人,依托现代光学仪器国家重点实验室,长期致力于光电一体化仪器研究与设计、光学计量测试理论、人工智能/深度学习在传统光学领域的应用等,研制了多种融硬、软件于一体的智能化光学仪器。在光机设计与调试技术、电子控制技术、移相干涉技术、标准透镜的设计与装调技术、干涉相位提取技术、高精度波面复原技术、基于人工智能/深度学习的数字图像处理技术、计算全息理论、点衍射干涉理论与技术、倾斜波面干涉理论与技术、空间同步偏振移相干涉理论与技术等方面具有雄厚的学术和技术基础。团队先后主持国家高层次科研项目30多项,研究成果获得国家科学技术进步二等奖两次、国防技术发明二等奖三次、教育部技术发明二等奖一次。