活细胞生物激光器的现状和未来

王秀翃

提到激光器,人们通常想到的可能是各种类型的传统激光发生器,很少有人会将微小的细胞和激光器联系起来。我们知道产生激光通常要有三要素,即光源,受激产生辐射的增益介质以及将所产生的光进行放大的“光学谐振腔”。一般激光器的增益介质多为晶体、陶瓷、有机染料及光纤等材料,而细胞激光器所采用的增益介质是具有生物活性的细胞,这突破了人们对激光器的传统认识。细胞激光器在2015年被评为了十大新型激光器之一。

细胞与激光的首次结合

细胞激光器的产生最初是源于研究人员的好奇心。激光研究人员曾经尝试使用各种状态和各种形状的材料作为增益介质来实现激光输出,包括气体,液体,固体以及陶瓷,晶体,光纤等。自然界中有没有生物材料可以发射激光呢?哈佛大学的光物理学者Seok-Hyun Yun 和Malte Gather对这一问题特别好奇,因此他们尝试了细胞作为增益介质的激光输出。

在自然界,有很多可以发光的物质,比如绿色荧光蛋白,它最初是从水母中提取出来的,在蓝光辐照下会发出绿色的光,其三维结构见图1A。绿色荧光蛋白的发现在生命科学研究领域具有里程碑式的意义,发现和研究绿色荧光蛋白的三位科学家因此获得了2008年的诺贝尔化学奖。它可以用于追踪细胞中的分子,报告基因的表达,被誉为生命科学中的指路明灯。Yun和Gather博士用表达绿色荧光蛋白的DNA质粒对人胚胎肾细胞进行转染,得到了可以表达绿色荧光蛋白的肾细胞。


图1.单细胞激光器 A 绿色荧光蛋白三维结构 B 单细胞激光示意图 C D E分别是低于阈值,阈值附近和高于阈值的出光模式 F G分别是低于阈值和高于阈值细胞内出光的空间分布模式

将此细胞置于珐珀谐振腔中,腔镜是由两面布拉格反射镜构成,腔长d在20微米左右,细胞直径在15微米左右,如图1B所示。泵浦光源为波长465nm的光参量振荡器,脉宽5ns,重频10Hz。经显微物镜对腔内细胞进行泵浦,并探测其输出光谱,得到了在不同泵浦功率下单细胞的激光输出,图1C,D, E,经实验测量泵浦阈值拟合结果在1nJ左右。泵浦能量低于阈值时,只是自发辐射发光(C);在阈值附近时,只有一个模式的震荡输出(D);随着泵浦功率的增加,其他模式的激光也得到放大输出(E)。在持续数分钟的激光放射后,细胞仍能保持其生理活性。虽然这种激光很微弱,持续时间只有几个纳秒,但能被清晰地探测到。除了人源细胞出光外,他们还实现了表达绿色荧光蛋白的单个细菌的激光输出。

自带谐振腔的细胞激光器

第一个活细胞激光器的成功实现为生物材料激光器研究打开了一扇门。但是第一个活细胞激光器使用了外加的谐振腔。为了更易于将激光器植入活体内,2015年,哈佛大学的Yun博士又在自己的实验室尝试了细胞内载有谐振腔的激光器—即基于回音壁模式微腔的细胞内激光器。

回音壁模式光学微腔是一种特殊的光学谐振腔,它突破了传统的基于腔镜光学谐振腔的限制,通过边界连续的全反射,可以将光子长时间地局域在微腔内形成回音壁模式的介质谐振腔。因其具有超高Q值、极小的模式体积、超高的能量密度和极窄的线宽等优越特性,成为一类典型的新型光学器件。回音壁模式微腔可以在环形或者球形的一些材料表面实现光信号的传输,在无标记传感探测领域具有其他光腔不可比拟的优势。目前已报道的回音壁模式微腔材料有液滴、二氧化硅、半导体和聚合物等材质。借助于微纳加工制造技术、光纤拉锥等技术,回音壁模式微腔得到了迅猛发展,

Yun博士和他实验室的Matja? Humar采用以下几种不同方式的回音壁微腔模式实现了细胞内激光输出:

向细胞内注入油滴,如图2A所示,油滴是混合了尼罗红染料的聚苯乙醚,其折射率为1.69,而油滴外细胞液折射率可近似为水的折射率1.33。根据折射率导光原理,油滴在细胞内会形成一个由尼罗红染料提供增益的微球腔。在波长535nm、脉宽5ns、重频10Hz泵浦光作用下,得到回音壁模式输出光谱,如图2C所示。在此基础上,考虑到猪皮的脂肪细胞内含有单一的形状规则的球形脂滴,将含有尼罗红的溶液注射到猪皮下脂肪组织中,细胞中的脂肪颗粒被尼罗红染色。在37℃、用535nm激光泵浦猪皮组织,输出信号经芯径200μm的多模光纤耦合至光谱探测器,得到了猪皮组织中脂肪细胞的输出光谱。

利用高折射率材料的回音壁微球腔。人体细胞具有内吞功能,可以将细胞外的物质通过内吞作用摄取到细胞内以维持正常的代谢活动。用人体宫颈癌HeLa细胞通过细胞内吞作用可以使直径11.5μm的荧光掺杂的聚苯乙烯微球进入细胞内部形成回音壁微腔,图2D,E。在泵浦激光辐照下,实现了细胞内的激光输出,图2F。除了将增益介质掺杂在回音壁微腔内之外,也可以将没有荧光掺杂的回音壁微球置于含有荧光染料的细胞质中,或者在微球表面包覆一层荧光染料,这样也能够实现基于回音壁模式微球腔的细胞内激光输出。


图2 基于回音壁微球腔的细胞内激光器 A 将油滴注入细胞内示意图 B含有油滴的细胞,红色为尼罗红染色的油滴,蓝色为细胞核 C 基于油滴微腔的细胞内激光输出 D 细胞内吞微球示意图 E 内吞聚苯乙烯微球的细胞,红色为细胞膜,蓝色为细胞核F 基于聚苯乙烯微球腔的细胞内激光输出。

植入组织中的激光器

在科幻电影中我们曾经看到过镭射眼。细胞激光器具有极好的生物相容性,如果植入生物组织内将不会引起机体的免疫反应,这为将激光器植入活体组织中提供了可能,活体组织发光将不再是梦想。2017年,Matja? Humar、Anja Dobravec等人报道了可植入牛眼角膜、血液和皮肤组织内的微型激光器,如图3所示。他们分别将直径8μm的绿色荧光聚苯乙烯微球植入新鲜的牛眼角膜内(n=1.37-1.38);直径40μm掺杂尼罗红染料的生物可降解PLA微球植入人血液内;以及直径49.8μm的尼罗红染料PLA微球植入猪皮组织内。分别实现了眼角膜,血液和皮肤表面下200微米深处的激光发射。


图3. 植入组织中的激光器 A 牛眼角膜 B 血液 C 皮肤组织

应用前景

在生物检测和成像领域,有望实现高灵敏检测和细胞内部成像,提高成像分辨率。荧光检测和成像技术因其可以提供丰富的分子信息是当今生物医学领域不可或缺的一项技术。但是由于荧光的谱带较宽,不利于多种荧光的同时检测以及高灵敏分析,这是荧光分析的瓶颈。而如果把荧光转变为激光,由于激光的光谱带宽非常窄,可以弥补荧光成像的不足突破荧光检测的瓶颈。另外,传统的光学显微技术利用不同组织结构对光的线性吸收(单光子)的不同来生成图像的对比度,但是这仅限于在靠近组织表面(小于 100微米)实现高分辨率成像。如果可以从内部成像,那么可能会得到具有更多细节的图像。现代的光学成像技术如共聚焦显微技术和多光子显微技术可以提供生物系统的具有亚细胞分辨率的成像。荧光显微镜成像的技术依靠使用荧光物质标记来对细胞或组织进行成像,而细胞内激光器可以生成更亮的激光用以提高它成像的分辨率。

可以用作细胞标签。人体是由上万亿个细胞组成的,细胞是生命活动的基本单位。基于细胞内的微型激光器原理,如果使用不同发射波段的荧光染料掺杂微球,结合使用不同尺寸的微球,那么可分辨的微球数量将大大增加,甚至可以达到人体内细胞数量。利用此项单一技术来单独标记靶向细胞,使得同时追踪上千个细胞成为可能,从而可以研究每一个细胞的生命活动过程,并进行目标组织细胞的定位。

细胞内环境监控。细胞内微型激光器就像是在细胞内安装了眼睛,可以实时观察细胞内的活动。并将观测结果以激光的形式传递出来。根据这一原理, 可以利用细胞内激光器来对细胞内的微环境进行监测,有望实现对一些危害人类健康的重大疾病(比如癌症)的早期检测和预防。

用于制作生物活性的元器件。目前的光学器件大多是非生命的物质,细胞激光器的出现,将有望制成具有生命活性的元器件。

综上,细胞激光器的实现为生物学和光子学领域的研究开辟了新的方向,但是目前其研究还处于初始阶段,其在生物学领域和光子学领域的各种新应用将会不断涌现。

该文章发表在《激光与光电子学进展》第55卷第12期,且被选为当期的封面文章,文章内容点击查看:

http://www.opticsjournal.net/Articles/abstract?aid=OJ181216000035A7D0cI

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