绕过衍射极限,通过移频技术,探索微观世界

封面文章|陈宇宸,李传康,郝翔,匡翠方,刘旭. 点扫描移频超分辨显微成像进展[J]. 激光与光电子学进展, 2020, 57(18): 180001

 

浙江大学刘旭教授团队在《激光与光电子学进展》发表题为“点扫描移频超分辨显微成像进展”的综述文章,被选为当期封面文章。

文中介绍了三种点扫描移频超分辨显微成像技术——并行探测技术、激光扫描移频显微技术、非线性焦斑调制技术,并介绍作者团队在该领域的成果,最后进行了总结。

 

撰稿:陈宇宸 李传康 匡翠方

背景

光学显微术能够让我们放大微小的物体,但是由于光学衍射的存在,一直以来常规光学显微镜的分辨率被限制在照明光波长的一半左右,严重限制了对于更细微结构的观察。

共聚焦显微成像技术的提出为绕过衍射极限提供切实可行的方法。共聚焦显微技术采用聚焦的高斯艾里斑进行点照明,再通过振镜等转动器件在样品面上进行点扫描,然后引入一个与物镜焦平面共轭的小孔来滤除焦外光,从而提高系统的光切片能力和信噪比,同时整个系统的有效点扩散函数也会由于小孔的存在被压缩,也就能获得更高分辨率的图像。

共聚焦显微成像技术作为最典型也是最早的点扫描显微技术,凭借着良好的光切片能力和高信噪比已然成为当前应用最为广泛的光学显微技术。

但由于其有限的截止频率以及在分辨率与信噪比之间需要做出的权衡,共聚焦显微成像技术的分辨率提升极为有限,无法满足人们在不断深入探索微观世界时对更细微物体的观测需求。

随着光电器件的性能提升和新型荧光探针的研制,科研工作者们提出了各种超分辨光学显微成像技术,在保留传统荧光显微镜特异性识别和直接快速成像等优点的同时,巧妙地绕过了衍射极限,实现了远超共聚焦显微技术的分辨率。

移频技术是将更高频的信息移动到可观察的频率范围,从而提高点扫描显微技术的分辨率。文章总结了三种点扫描移频超分辨显微技术:并行探测技术、激光扫描移频显微技术、非线性焦斑调制技术。

并行探测技术

并行探测技术于1988年由Sheppard提出并在2010年被实验证明。其用于解决共聚焦显微系统中一个令人头痛的问题:如何选择合适的针孔尺寸来权衡图像的两个关键参数——分辨率和信噪比。

它的基本原理是通过阵列探测器或点探测器阵列替代传统共聚焦显微镜中的单个点检测器,从而并行地接收一系列图像,再将这些图像融合,在极大地提高共焦显微成像的探测信号强度的同时,将其分辨率进一步提高至接近衍射极限的2倍。

从频域的角度来说,并行探测技术通过小针孔和阵列探测器中的离轴像素或子探测器来拓宽系统的频率带宽,再利用像素重组算法恢复物体的高频信息。当然,这个像素重组的过程也可以通过全光学的方式实现,从而有效减少了处理原始数据所耗费的时间。更显著提高成像速度的方法是采用多焦点激发和并行读取的方式进行快速并行探测成像。

并行探测这种简单而有效的方法很快被应用于拉曼显微成像、受激发射损耗显微成像、荧光寿命显微成像、反射光显微成像、双光子显微成像、量子显微成像等研究领域,并迅速商业化,成为生物、材料等领域常用的观察工具。

图1 并行探测系统示意图。左图是由32个点探测器组成的探测器阵列示意图[1]

激光扫描移频显微技术

激光扫描移频显微技术的基本原理是在共聚焦显微系统上得到一组类似于结构光照明显微成像技术(SIM)的原始数据。如图2所示,主要有两种方法:

一种是通过入射激发光的峰值强度调制以及宽场探测器的时间累积成像来合成一个有效的结构照明场,称为扫描图案照明显微技术(SPIN)。

另一种是利用探测端的掩模和单点探测器的空间累积成像来实现系统的空间频移,称为扫描图案探测显微技术(SPADE)。之后采用传统的SIM算法来提取位于显微系统通带外的频率分量,就能够在同样达到两倍于衍射极限的分辨率下,克服了结构光照明显微成像技术无法进行厚样品成像的缺陷。

图2 (a)SPIN系统装置示意图。(b)SPADE系统装置示意图[2]

作者课题组提出了一种虚拟k空间调制光学显微技术(VIKMOM),同样在探测端使用数字掩模进行虚拟调制产生一系列SIM数据,如图3所示。不同的是,最后重构超分辨图像是采用的是一种改进的傅里叶叠层成像算法而不是传统的SIM算法,因此对噪声不敏感,且能校正未知光学像差。而多焦点饱和虚拟调制技术则利用荧光饱和激发的非线性效应以及多焦斑照明技术分别提高了激光扫描移频显微技术的空间分辨率和时间分辨率。

图3 VIKMOM示意图及其用于超分辨率图像恢复的解码过程。(a)成像系统原理; (b)用于超分辨率图像恢复的解码程序流程图 [3]

非线性焦斑调制技术

非线性焦斑调制显微技术(NFOMM)通过适当的聚焦光场调制(相位调制产生的点扩散函数的空间频率重新分配和强照明引起的饱和激发调制),利用非线性发射效应保留来自物体的大量高频分量,来扩展系统的有效空间频率带宽。在将样品的高空间分辨率信息在一个或多个相位调制下移入系统的检测通带后,使用有效系统光学传递函数描述的正向模型对采集的图像进行后处理,以重建出具有超高分辨率的成像结果。

如图4所示,饱和空心照明视图(SDI view)和饱和线状照明视图(SLI view)在荧光激发的非线性效应以及相位调制产生的PSF空间频率的重新分配下携带了明显增多的高频分量信息。而其频率缺失的问题(图4(d,iii)中黑色虚线圆圈处)能够利用多视图重建的后处理算法通过高斯照明视图(GI view)弥补。

作者课题组还将非线性焦斑调制显微技术与交错重建算法以及并行探测技术相结合,进一步提高了成像速度和信噪比,实现了超高时空分辨率的荧光显微成像。

图4 NFOMM工作原理和成像结果。(a)焦斑调制示意图。 (b) PSF与OTF;(c) OTF曲线分析;(d)辐条状样品的成像结果;(e-f) NFOMM与标准共聚焦显微镜对于Vero细胞的双色成像结果 [4]

总结

如今,各种超分辨显微成像技术层出不穷,但是点扫描移频超分辨显微成像技术凭借其自身的优势在高分辨率活体显微成像中始终发挥着极为重要的作用。

并行探测技术普适性强,可以与其他显微成像技术结合,发挥共性优势;激光扫描移频技术具有低噪声的特点,可以在厚生物样品等高散射介质中成像;而非线性焦斑调制技术大大简化了系统复杂性,且具有较高的空间分辨率,其算法可被推广应用到其他基于暗斑调制的成像技术。

当然,作为一种新型超分辨技术,在实际应用中,仍然存在一些在生物普适性上的不足。例如,非线性焦斑调制技术要求饱和照明,生物样品需要具备一定的抗光漂白能力,并且需要对几张图像进行后期处理,合成一帧超分辨图像,降低了该技术的成像速度。在未来的研究中,可采用并行处理提高其时间分辨率。我们有信心,随着现代科学技术的发展,点扫描移频超分辨技术将成为一种标准的显微技术,并为生物、医学、材料等研究领域探索微观世界的奥秘提供更有利的工具。

参考文献

[1] Ge B, Wang Y, Huang Y, et al. Three-dimensional resolution and contrast-enhanced confocal microscopy with array detection[J]. Optics Letters, 2016, 41(9): 2013-2016.

[2] Lu J, Min W, Conchello J, et al. Super-Resolution Laser Scanning Microscopy through Spatiotemporal Modulation[J]. Nano Letters, 2009, 9(11): 3883-3889.

[3] Kuang C, Ma Y, Zhou R, et al. Virtual k -Space Modulation Optical Microscopy[J]. Physical Review Letters, 2016, 117(2).

[4] Zhao G, Zheng C, Kuang C, et al. Nonlinear Focal Modulation Microscopy[J]. Physical Review Letters, 2018, 120(19).

 

课题组介绍:

浙江大学刘旭教授课题组主要从事超分辨显微成像新原理、新仪器的创新研究。

主要研究成果包括:(1)针对现有荧光超分辨的不足,提出了虚拟移频技术,荧光非线性移频机理,开拓了一种超分辨的新方法。(2)提出了一种新的荧光发射微分超分辨方法,并取得了一系列成果,其最大特点是不需要特殊荧光染料,大大降低了样品的制备难度,应用范围更为广泛。(3)提出了单波长非线性竞争的新方法,使光剂量可以降低一个数量级,分辨率达到l/13。

成果获得2019年中国技术发明二等奖,2018年度中国光学科技奖一等奖,2016、2017、2019年度三次中国光学十大进展(应用类)等。

 

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