封面| 郜鹏:相位成像,为透明样品增添“色彩”

西安电子科技大学郜鹏教授等人受邀撰写的“高稳定性定量相位显微技术”的综述论文,被选为当期的封面文章。

文章主要就物参共路数字全息显微和单光束相位显微两个方面综述了高稳定性定量相位显微技术的最新研究进展。

撰稿| 温凯

研究背景

光学显微镜自十六世纪诞生以来,就一直作为人们观测和认识微观世界的重要手段。与电子显微镜相比,光学显微镜对样品的损伤小,适用于活体样品的快速成像。然而,传统的光学显微只能获取样品的强度信息,对于透明样品的观测则显得无能为力。

定量相位显微(QPM)将相位成像和光学显微技术相结合,为观测透明样品提供了一种快速、无损、高分辨率的成像手段。

如图1所示,当一束平行光波在样品表面反射(或穿过透明样品)时,样品的三维形貌(厚度分布/折射率分布)会引起反射光波(透射光波)相位的变化。通过对反射光(透射光)进行相位成像,便可以得到待测样品的三维形貌(厚度或折射率分布)。因此,相位成像可被广泛应用于工业检测、生物医学成像、特殊光束产生、气体流体可视化,以及自适应成像等领域[1]。

图1 定量相位成像原理及应用

相位成像将光波的波长(长度为几百纳米)作为“标尺”,以实现对样品三维形貌或厚度分布的 “度量”,具有极高的测量精度。然而,由于相位成像极易受到环境的干扰。因此,如何提高定量相位显微技术的稳定性已成为光学显微领域的研究热点之一。下文将围绕这一热点,着重介绍物参共路数字全息显微技术和单光束定量相位显微技术。

物参共路数字全息显微技术

数字全息源于光学全息,迄今已有70年的发展历程。

1948年,Gabor以全息干板作为记录介质,率先提出了全息记录和光学再现的方法。

20世纪90年代,由于CCD/CMOS的出现,全息图的记录和再现可以借助计算机来实现。这为全息技术的发展迎来了新的春天。

数字全息显微(DHM),是数字全息和光学显微的结合。其成像原理如图2(a)所示:照明光被分成两束光,一束光穿过样品并被显微成像单元MO-CL放大,形成物光;另一束光被用作参考光;通过记录物光与参考光干涉形成的全息图(如图2(b)所示),可以再现出被测样品的振幅和相位信息(如图2(c)和图2(d)所示)。对于该待测透明样品,相位图像不但显著提高了成像对比度,还量化了样品所引起的照明光的光程差变化。

图2 数字全息显微技术原理及重建结果。(a)数字全息显微技术原理;(b)物光和参考光干涉图样;(c)重建的振幅图像;(d)重建的相位图像。

虽然数字全息显微具有传统光学显微无可比拟的优点,但仍然存在着一些不足与缺憾。

如图2(a)所示,目前的DHM装置大多采用物参分离的光路结构,外界环境的扰动会影响全息图的记录和再现。为了克服环境扰动对DHM成像的影响,国内外众多学者开展了大量研究。

目前,提高装置稳定性的常用方法有:气垫隔振法、真空封闭式隔振法,以及负反馈电子线路隔振法。虽然这些方法隔振效果明显,但反馈系统不仅价格昂贵,还增加了装置结构的复杂性。

此外,研究学者也提出物参共路数字全息显微技术(如表(1)所示)来克服环境扰动对相位成像的影响。物参共路DHM的优点在于,物光和参考光历经完全相同的光学元件,环境扰动对物光和参考光具有相同的干扰,所以不会影响到物光与参考光之间的相位差。经实验证明,物参共路DHM具有极高的稳定性,3小时内光程差起伏仅为0.53 nm[2]。利用物参共路DHM可以对一些微观过程进行(如草履虫的食物泡运动和螺旋前进过程)高衬度、定量化相位成像,如图3所示。

 

图3 点衍射DHM对草履虫食物泡运动(a)和螺旋前进过程(b)的实时相位成像。

表1 常用物参共路数字全息显微技术及特点

单光束定量相位成像技术

基于光学干涉的DHM具有很高的相位测量精度,但需要引入额外的参考光,对光源相干性要求较高。为了克服这一缺点,研究者发展了单光束相位成像技术。该技术无需参考光,凭借结构简单,抗干扰强等优点,逐渐受到人们的青睐。目前常用的单光束相位成像技术大致分为以下几类:

(1) 基于微透镜阵列或棱锥的波前传感技术(Hartmann-Shack):该传感器主要由二维微透镜阵列和面阵CCD组成。传感器上的微透镜阵列将入射光波面分割成许多子波面。微透镜的焦点会由相应的子波面引起横向移动,从而实现对子波前的探测。该方法结构简单、灵活性好、动态范围大、光学效率高、无运动部件,对环境适应能力强,被广泛应用于自适应光学等领域。然而,由于受到微透镜孔径(~100 μm)的限制,该技术的空间分辨率无法满足对生物样品相位成像的要求。

(2) 定量微分干涉显微:该技术将显微放大后的物光分成平行的两束,两束光通过在水平方向上错开一定的距离从而发生剪切干涉。最终通过分别测量样品在剪切方向上的相位梯度来计算样品的相位分布。该方法适用于连续性物体的相位成像,不能对阶越性相位物体进行测量。

(3) 基于迭代的单光束相位成像技术:该技术通过记录样品在不同离焦平面、不同波长、不同孔径,以及不同结构光照明下的衍射图样,并结合迭代算法再现出样品的相位分布。该方法结构简单,但是再现耗时较长。

(4) 单光束共轴数字全息显微:该技术通过单幅离焦的衍射图样(或称同轴全息图),可以再现出样品的复振幅分布。然而,由于全息图再现时,零级像与孪生像在空间频谱上难以分开,因而会影响再现图的质量。近年来国内学者通过[3]将压缩感知(Compressive Sensing, CS)与共轴全息技术相结合,消除了孪生像对重建结果的影响,成功地实现了共轴数字全息的高质量再现。

(5) 定量相衬显微:1942年,泽尼克提出采用环状光源照明样品,同时采用一个环状相位板对物光波的零频分量进行相位延迟,从而将样品的相位信息转换为强度信息,实现了相衬显微。由于被测物体的相位和干涉图样的强度之间是非线性的,所以传统的泽尼克相衬成像(只有单幅干涉图)只能定性地观测样品。空间光调制器(SLM)的出现使研究者可以方便地对零频分量的相位进行调节(如0,p/2,p),从而定量地获得样品的相位成像。研究者利用环形LED阵列作为照明光源,利用SLM作为相移器,实现了对内质网网络结构、线粒体等结构的定量相位成像[4]。

 

图4 基于超斜照明的量化相衬显微。(a)光路示意图;(b) Cos7细胞动态过程相位成像。

总结与展望

定量相位显微,通过获得物光波的振幅和相位信息,为探测微观样品的三维形貌或折射率分布提供了一种高分辨、快速、无损的有效手段。物参共路数字全息显微技术和单光束定量相位显微技术都可以有效地克服环境扰动带来的不利影响。两者相比,前者具有更高的相位恢复精度,后者结构简单,对光源相干性要求低。随着高稳定性定量相位显微技术的进一步研究,该技术将在工业检测、生命科学等研究领域中发挥越来越重要的作用。

 

参考文献:

[1] Micó V, Zheng J, Garcia J, et al. Resolution enhancement in quantitative phase microscopy[J]. Advances in Optics and Photonics, 2019, 11(1): 135-214.

[2] Popescu G, Ikeda T, Dasari R R, et al. Diffraction phase microscopy for quantifying cell structure and dynamics[J]. Optics letters, 2006, 31(6): 775-777.

[3] Zhang W, Cao L, Brady D J, et al. Twin-image-free holography: a compressive sensing approach[J]. Physical review letters, 2018, 121(9): 093902.

[4] Ma Y, Guo S, Pan Y, et al. Quantitative phase microscopy with enhanced contrast and improved resolution through ultra‐oblique illumination (UO‐QPM)[J]. Journal of biophotonics, 2019, 12(10): e201900011.