使用频率梳测量荧光寿命：新型荧光显微成像方法

荧光显微成像技术可让科学家直接观察细胞及细胞内外部某些化合物，因此在生物化学和生命科学领域中得到了广泛的应用。这种技术的原理是利用荧光分子吸收特定波长范围内的光线，然后在较长的波长范围内重新发出光线。然而，传统荧光显微技术有一个主要的缺点：由于荧光分子所发出的荧光强度在很大程度上取决于实验条件和荧光物质浓度，因此其测量结果难以量化。如今，日本科学家的一项新研究将彻底改变荧光寿命显微成像技术。让我们一起一探究竟！

克服传统荧光显微技术缺点的一个解决方法是：不测量荧光强度，转而测量荧光寿命。当荧光物质被一束短脉冲照射时，产生的荧光不会立即消失，而是随着时间的推移“衰减”；其衰减的特征与物质种类相关，不受实验条件的影响。荧光寿命显微技术正是利用了这一现象，以准确量化荧光分子及其所处环境的变化。然而，荧光衰减速度非常快，根本无法使用普通照相机测量；单点光电探测器虽然能够测量荧光衰减，但必须对整个样本区域进行扫描，才能从每个测量点重建出完整的二维图像；由于扫描过程涉及到机械部件的移动，极大地限制了成像的速度。

图1 实现无扫描荧光寿命成像的44400个“光学秒表”排布（德岛大学供图）

幸运的是，在最近发表在Science Advances上的一项研究中，来自日本的科学家团队开发了一种无需机械扫描即可实现荧光寿命成像的新方法。领导此项研究的是日本德岛大学Post-LED Photonics研究所的Takeshi Yasui教授。他解释道：“形象的说，我们的方法就是在二维平面上同时投射出44400个‘光学秒表’测量荧光寿命；所有的‘光秒表’都在一次测量中完成，无需扫描过程。”那么具体是如何实现的呢？

此方法的主要原理是使用光学频率梳作为样品的激发光。光学频率梳本质上是许多频率间隔固定的离散光学频率组成的光信号。“梳”指的是信号与光频率的关系：频率轴上的密集等距的尖峰光脉冲，就像梳子的齿一样排列。利用专用的光学设备，将一对激励频率梳信号分解为具有不同强度调制频率的单个光拍信号（双梳光拍），每个信号都具有特定的调制频率，并将其照射到目标样品上。关键在于：每束光都照射到样本不同的空间位置上，使得样本二维表面的每个点（即一个像素）与双光梳拍频的每个调制频率之间一一对应。

由于样品的荧光特性，重新发射部分所接收到的辐射。所发出光仍然保持上述的频率-位置对应关系；发出的荧光被直接聚焦在高速单点光电探测器上；最后，借助数学运算将测量信号转换为频域信息，根据调制频率处的激励信号与测量信号之间的相对相位延迟，很容易计算出每个“像素”处的荧光寿命。

由于其高效的成像速度和高空间分辨率，此次发明的显微成像技术将可最大程度利用荧光寿命测量的优势。Yasui教授说：“我们发明的技术不需要机械扫描，一次可同时测量整个样本，因此可用于生命科学中对活细胞的动态观察。”除了帮助更加深入了解生物过程，这种新方法还可用于抗原检测中同时对多个样本成像，目前已被用于COVID-19的检测中。

这项研究最大的价值也许在于：证明了现如今常被用作“频率尺”的光学频率梳，可以在显微技术中大显身手，以推动生命科学研究百尺竿头，更进一步。基于此，有望开发出治疗顽固性疾病的新方法、提高预期寿命，从而造福全人类。

原文见：http://dx.doi.org/10.1126/sciadv.abd2102

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