基于四象限液晶器件的差分相衬成像系统
1 引言
在显微成像领域中,由于无色生物样本的振幅吸收率低,常规显微镜观测下,成像对比度很低,传统方法多采用对其染色的方法使其在显微镜下被观测。然而对于生物样本,化学染色方式使得生物样本失活,对生物样本进行荧光染色时,所采用的激光照明的方式又会不可避免地产生光毒性[1],对生物样本有损伤,难以对活体细胞进行长时间的观测。因此,无标记的相位成像方法成为了生物观测中逐渐采用的方式,并在近年来蓬勃发展[2-3]。相衬显微镜和微分干涉显微镜[4]的出现为人们观测细胞提供了新的方式。根据光的干涉以及衍射将样品的折射率信息即相位差转换为振幅差,实现了无需标记的无色透明样品观测。为了更进一步提升成像性能,1984年Hamilton首次提出了差分相衬成像方法[5],通过将分离式探测器与扫描式显微成像系统相结合,实现了对样品三维信息的定性观察。2014年Guo等人提出使用液晶显示器件作为空间光调制器[6],实现了显微镜的多模态成像功能。2015年,Tian等[7]通过将LED阵列作为照明调控模块,提出了定量的差分相衬成像方法。同年Zuo等人[8]通过对现有倒置显微镜进行优化,在显微成像系统中外接一个4F系统,在4F系统中两透镜的共焦平面放置一款商用LCD显示屏进行调控,实现了差分相衬成像等多种成像模式。然而在实际场景下,商用LCD的显示器尺寸大,对于一般的显微镜成像系统,聚光镜后焦面位于机械可调光阑处,难以将商用LCD器件放在聚光镜后焦面处。并且商用LCD因其结构存在黑矩阵遮光膜,导致其对光的透过率低,其彩色滤光膜也会进一步影响透过率。对于差分相衬成像系统来说,这几种因素会影响系统成像性能的进一步提升。
为了实现活体细胞观测系统的小型化、集成化、高对比度、低成本需求,贴近差分相衬成像的应用场景,本文提出了一种可调控的显微镜聚光镜模块,目前在商用显微镜OLYMPUS CX23上进行优化改装,所设计使用的四象限液晶器件尺寸仅为22 mm×18 mm,可嵌入于显微镜聚光透镜的前焦平面处。
2 成像模型与理论
2.1 成像系统的构成
图 1. 液晶差分相衬成像系统结构图
Fig. 1. Structure diagram of liquid crystal differential phase contrast imaging system
2.2 定量差分相衬成像算法原理
定义薄样品为一个纯相位物体:
其中:
在某一角度的照明下,样品平面上的复函数为照明函数
为了线性化地恢复样品的相位信息,忽略计算过程中的二次交叉项[11]。在正常照明情况下,照射到样品平面上的光源是空间部分相干光,那么强度谱
式中B代表背景项:
系统的相位传递函数PTF为:
我们使用两个正交轴上的4张非对称照明下采集到的图像,计算样本的相位对比图像[5,12]:
对
更新后差分情况下的相位传递函数整合为:
这里的
式中:
2.3 液晶器件的设计
根据差分相衬成像的照明调制需求,研究扭曲液晶器件的透过率特性以及响应速度特性,设计并制作扭曲液晶器件。扭曲液晶器件的透过率T与器件的调制量u的关系式如
式中:T为液晶器件的透过率,
图 3. 液晶器件透过率与调制量关系图
Fig. 3. Relationship between transmissivity and modulation of liquid crystal device
液晶器件的响应时间定义为加电时和断电时透光率变化10%所需要的时间,前者为上升时间,后者为下降时间,分别用
式中:
图 4. 实验测得相对透过率与时间曲线
Fig. 4. Relative transmittance versus time curve measured experimentally
液晶器件嵌入显微镜聚光镜模块的前焦平面处,由于聚光镜模块的空间限制,前焦平面的空余区域为直径为30 mm的圆形区域,液晶器件通过转接嵌入聚光镜前焦平面镜处,因此液晶器件的尺寸定为22 mm×18 mm,其中通光区域的大小为16 mm×16 mm,可以提供匹配40x物镜的照明NA。
3 实验结果与分析
实验系统搭建在商用显微镜OLYMPUS CX23上,将设计制作的小型扭曲液晶器件通过转接件安置于显微镜聚光透镜的后焦面处。
3.1 微凸透镜阵列成像实验
为了验证所搭建系统的成像性能,我们对微凸透镜阵列进行成像实验。物镜放大倍率为20×,0.4 NA。使用微透镜阵列的参数为单个截面尺寸为288 μm,曲率半径为9 764 μm,根据几何关系计算出微透镜阵列的厚度约为1 061 μm。空气介质的折射率参数
对微凸透镜阵列进行定量相位重建实验,解算获得的定量相位图像如
为了量化相位重建的效果,我们绘制了单个微透镜某一方向上的相位变化曲线并与理论曲线进行对比,如
理论计算经过微透镜阵列的相位差为[14]:
理论计算经过微透镜阵列的最大相位差为5.71 rad,实验测得为5.60 rad,与理论值差2%,结果展现了98%的准确率。
皮尔逊相关系数是衡量曲线相似度的一种方式,输出范围为-1~+1,其中0代表无相关性,负值代表负相关,正值代表正相关。
Pearson相关系数计算方式如
我们对实验解得的微透镜阵列的相位图像中单个微透镜的某一方向上的相位差值曲线与理论曲线进行相关性计算,得到相关系数为0.994 7,结果表明了系统定量相位成像的高精确度。
3.2 胚胎干细胞成像实验
验证了系统的定量相位成像能力后,我们对胚胎干细胞进行了定量相位重建实验,成像效果如
图 7. 胚胎干细胞明场图像和重建相位图像
Fig. 7. Embryonic stem cell bright field image and reconstruction phase image
4 结论
本文提出了一种可调控的显微镜聚光镜模块,根据差分相衬成像的照明调制需求设计了聚光镜模块中的小型液晶器件进行调控,所设计的器件尺寸为22 mm×18 mm,对比度达到350∶1,响应速度为21 ms。通过微凸透镜阵列的实验验证了根据该模块搭建的系统的定量相位成像性能,胚胎干细胞成像效果进一步体现了本文在实际场景中的应用效果。本文所设计的液晶器件只是初步的应用尝试,未来可以通过选择其他参数液晶材料进行设计,如快速响应液晶,制作出对比度更高,响应速度更快的液晶器件,为未来实现高成像速度的实时活体成像系统打下良好的基础。
[11] BORN M. Principles of optics-electromagnetic theory of propagation, interference and diffraction of light[J]. Diffraction Theory, 1975: 568-574.
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吴沛霖, 彭增辉, 穆全全, 宣丽, 张世冬, 李大禹. 基于四象限液晶器件的差分相衬成像系统[J]. 液晶与显示, 2023, 38(4): 456. Pei-lin WU, Zeng-hui PENG, Quan-quan MU, Li XUAN, Shi-dong ZHANG, Da-yu LI. Differential phase contrast imaging system based four quadrants liquid crystal device[J]. Chinese Journal of Liquid Crystals and Displays, 2023, 38(4): 456.