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中国光学学会
《中国激光》创刊50周年 | 深层生物组织光学：突破高分辨率光学技术穿透深度限制
《中国激光》创刊50周年 | 深层生物组织光学：突破高分辨率光学技术穿透深度限制
一、背景介绍
光学技术具有非电离辐射、高分辨率、高对比度和对生物组织异变高度灵敏等特性，在生物医学中扮演着越来越重要的角色，非常适用于生物组织的研究，包括成像、传感、治疗、刺激以及控制等等。然而由于生物组中光学折射率分布不均，光在生物组织中的传播会受到很强的散射影响，导致了纯光学技术的穿透深度和空间分辨率“鱼和熊掌不可兼得”；高分辨率光学成像应用仅限于样品浅表层，当成像深度增加时分辨率急剧下降。如何实现光在深层生物组织里的高分辨率成像或应用，是人们期盼已久的目标。
香港理工大学赖溥祥教授课题组从光在生物组织中的传播特性出发，综述了领域内光-声结合和光学波前整形等最新技术进展，以及相关技术在生物组织光学调控、成像、以及光学计算等方面的应用，并展望了发展趋势。
二、深层生物组织光学技术方法
1、传统光学方法
目前对于深层组织成像的传统光学方法主要可划分为三类：波长转换、能量转换、相位补偿。波长转换主要包括多光子荧光、上转换等过程。多光子荧光的特点是目标分子在激发前同时吸收两个或更多的光子，其相比于单光子成像具有更深的成像深度。能量转换把输入的光能量转换成另一种形式的能量（如超声），减少被探测信号的散射，从而提升成像的深度，如图1所示，即为目前主要的各类光声成像方式示意图。
图1 光声成像原理及其代表实现形态，譬如光声断层扫描成像（PACT）、光声显微镜（PAM）以及光声内窥镜（PAE）的示意图
相位补偿方法通过光学器件来测量和补偿光学波前畸变，主要包括光学相位共轭（OPC）和直接自适应光学（AO）。OPC通过干涉记录散射介质内部引导星位置散射光的相位分布，并利用相位共轭镜对反方向传播的入射光的波前进行共轭补偿，重新使光聚焦到引导星位置，如图2所示。AO通过测量并补偿成像过程中的相位畸变，实现对光学系统的动态校正。AO有直接（使用波前传感器测量相位畸变）和间接（使用软件算法代替波前传感器）两种实现系统。
图2 时间反演超声编码（TRUE）光学聚焦实验
2、计算光学方法
（1）数字相位共轭（Digital optical phase conjugating，DOPC）
DOPC技术利用算法及空间光调制器（SLM）来实现相位共轭的技术，其基本物理原理与光学相位共轭相同，但不需要传统OPC方法中的相位共轭镜作为相位共轭镜。DOPC对引导星位置的散射光进行全息测量并用相机记录，用数字全息方法提取散射光相位并进行共轭操作，将计算所得共轭相位加载至SLM调制入射光波前，补偿散射介质的相位畸变，在散射介质内部或后面聚焦，如图3(a)~(d)所示实现在散射介质内部的光聚焦。
（2）迭代优化的波前整形（Iterative wavefront shaping，iWFS）
iWFS基于更简单的光学系统，无需参考光路，根据反馈信号调整入射光波前的相位，并经过多次迭代后不断提升焦点的亮度。反馈信号包括焦点处光强（Intensity）、聚焦对比度（PBR）、光声信号[图3 (e)~(f)]等多种形式。但聚焦前需要进行多次迭代优化，目前还很难实现生物组织中的实时聚焦。
图3 时间反演可控扰动[TRAP, (a)-(d)]与光声引导波前整形[PAWS, (e)-(f)]
（3）传输矩阵方法（Transmission matrix，TM）
为实现实时成像，可预先推导出在空间不同位置实现在该点聚焦所需的对应波前补偿图案，从而实现快速光栅化扫描。在测量TM的过程中，需要向散射介质投射大量不同的调制光（如哈达玛基，Hadamard basis）并记录相应的输出，由输入和输出光场之间的关系推算出TM，再通过矩阵逆运算推导出实现不同位置聚焦或图案透射所需的补偿波前。
（4）反射矩阵方法（Reflection matrix，RM）
传输矩阵TM的测量需要获得透过深层生物组织的光反馈信号，因而难以用于无创深层生物组织。在实际应用中，我们可以通过无创方式，获得反射或者背向散射的部分光信号，并根据反射光信号预测透射光信号，从而实现无创深层生物组织成像。
（5）自相关成像（Autocorrelation）
在散射介质中存在一个狭窄的范围，输出光场会随着输入光场的平移/倾斜而发生相应的平移/倾斜，即光学记忆效应（ME）。在ME范围内，可以认为图像自相关与散斑自相关近似相等。通过计算散斑的自相关，然后再使用相位恢复（PR）算法，即可重建原始图像信息。
3、深度学习方法
近年来人工智能技术，尤其是深度学习（DL）算法的突破性发展，为解决散射介质和深层生物组织成像中的复杂问题提供了一个全新且强大的工具。DL 通过构建深层神经网络（DNN）来学习并提取大量数据中的输入与输出关系之间的特征。在深层生物组织成像中，可以通过训练DNN来构建输入波前与输出波前之间的映射关系，从而直接从散斑图案中恢复原始图像，不再需要进行聚焦和光栅化扫描，可有力简化成像过程，提升成像速度。2022年，Zhao等提出基于光学散斑的加密系统（如图4所示），将光学散斑作为信息加密载体，并设计了基于U-Net的DNN，实现了从光学散斑中恢复人脸，所恢复的人脸保真度高，可用于人脸识别等应用。
图4 基于光学散斑的人脸识别加密系统流程图。（a）加密：将明文（人脸图像）加载到空间光调制器上，当激光穿过散射介质后，生成对应的密文散斑；（b）解密：将散斑输入预训练的神经网络进行解密；（c）人脸识别：将解密图像与已知人脸编码进行对比
4、光纤介入方法
随着光纤光学和光场调控技术的发展，基于光纤直径小（约100~200 μm，相当于成年人头发丝直径）、可弯折、双向光传输等特性，目前已有许多基于多芯光纤（MCF）实现光学内窥的相关研究和商业产品。同时，利用波前整形技术调控多模光纤（MMF）的输出光场，使得基于单根多模光纤实现高分辨率内窥显微成像成为可能。
（1）光纤荧光内窥镜
MMF也可被视作一种散射介质，前面提到的克服光学散射进行成像的方法同样适用于MMF成像。2010年Popoff等通过测定TM的方法实现了基于TM的单根多模光纤成像。2022年，Sun等提出了远场散斑幅值转换算法（FAST），并将其应用在定量相位成像（QPI）中，实现了通过无透镜的超薄光纤束内窥镜对凝胶微粒进行三维成像。2023年，Wen等提出了空间频率域编码追踪自适应信标光场编码方法（STABLE），并将其应用于单根MMF内窥镜，展示了小鼠肠道的体内成像结果。
（2）光纤光声内窥镜
2022年，Liang等设计了一种基于光学外差超声探测的光纤光声内窥镜，使用光纤传导激发光到成像部位，并采用光纤超声传感器将超声信号转换为激光频率变化，然后以光外差探测方式读取光声信号，如图5所示。该光纤超声传感器具有尺寸小（探头直径仅2 mm）、灵敏度高、不受电磁干扰等优势，适合深层生物组织中的超声信号检测。
图5 光纤光声内窥镜及成像示意图，（d）图中比例尺为1 mm
5、基于光纤的光遗传学
为避免传统光遗传学研究中的开颅手术，可以通过光纤将激光传输到特定目标区域，通过波前整形技术实现深层组织的高分辨率激活光敏蛋白质并记录其产生的荧光信号，实现对特定细胞或组织的神经活动成像。2021年，Zhong等通过TM方法操纵MMF的输出光场，并通过光栅化扫描实现脑区深层应用场景下对神经元的精准调控，如图6所示。
图6 基于多模光纤的精准光遗传学调控
三、总结与展望
深层生物组织光学的发展前景广阔，基于物理模型的传统光学、计算光学、光纤光学与基于计算和数据驱动的深度学习相结合，各类方法对光学系统的成像深度、速度或者分辨率都有很大的提升，如表1所示。展望未来，不断发展的深度学习与传统光学、计算光学、光纤光学相结合，有望进一步促进深层生物组织光学研究的发展并推进其在生物医学中的应用。
表1 不同深层生物组织光学方法的对比
课题组介绍
（课题组部分成员合照，中间为赖溥祥博士）
赖溥祥博士，2011年博士毕业于波士顿大学，2015年入职香港理工大学生物医学工程系，创立生物光子学实验室，现为终身副教授（博导），实验室主任。赖博士长期致力于声光结合及其在生物医学成像、治疗以及操控领域的应用研究，以第一或通讯作者在Nature Photonics, Nature Communications, The Innovation, Light: Science & Applications, PhotoniX, Advanced Photonics, Advanced Science等学术期刊发表论文90余篇，多次获得国际会议最佳论文荣誉。2017年起主持国家自然科学基金、香港特别行政区大学教育资助委员会、香港创新科技署、广东省科技厅、深圳市科技创新委员会等基金20余项。目前担任中国光学学会生物医学光子学分会常委，中国生物医学工程学会生物医学光子学分会委员，Visual Computing for Industry, Biomedicine, and Art (VCIBA)副主编，以及The Innovation, The Innovation Medicine, Advanced Photonics Nexus, Advanced Imaging, Journal of Innovative Optics in Health and Science (JIOHS)等学术期刊编委。