荧光自相关光谱技术检测抗原抗体亲和力 下载: 897次
1 引言
免疫分析法是以抗原-抗体特异性结合生成免疫复合物为理论基础的一种检测方法,主要用于检测生物样品中有无活性物质和特定物质的含量[1]。目前免疫分析法在生物学、临床医学以及环境分析、食品、药物学等领域得到非常广泛的应用[2-3]。传统的免疫分析方法为非均相免疫分析,它需要在检测前将免疫反应混合体系中抗原-抗体结合的标记物和未结合的标记物进行分离,因此整个过程操作繁琐、分析耗时长且检测通量低,不能满足快速检测和诊断的要求。近些年不断发展出多种均相免疫分析方法,检测时不需要将受测样品中的抗原-抗体结合和未结合的标记物进行分离,且检测速度快,检测通量高。常用的方法有荧光偏振免疫分析法[4]、荧光共振能量转移[5]和表面等离子共振技术[6-7]、太赫兹光谱技术[8-9]等分析技术。然而,这些分析方法或者受背景荧光和光散射的干扰导致信号的信噪比较低[4],或者对样品制备有特殊的要求:包括样品标记[5]、传感器芯片和样品量[6]、分析算法限制等,以上因素导致产品推广受到很大限制。在实际应用中,随着对低丰度分析样品的检测需求逐渐增多,发展高灵敏且操作简便的快速免疫分析技术成为免疫分析方法的主要发展方向。
荧光相关光谱(FCS)[10-11] 是一种极具潜力的均相免疫分析方法[12]。它具有灵敏度高(检测精度可以达到纳摩尔级别[13])、所需样本少(几十微升)和检测时间短(几十秒到数分钟)等优点。通过检测溶液样品中一个极小的微观体积(数个飞升,1 fL=10-15 L;约一个细菌大小)内的荧光信号波动,FCS技术可以提供受测荧光分子的多项水动力学特性,例如微观体积内平均荧光分子个数,以及受测分子的特征扩散相关时间等。传统FCS技术分析抗原-抗体亲和力是计算抗原-抗体的解离常数,解离常数越小,说明抗原和抗体之间的结合强度越大。具体计算方法是使用荧光相关光谱仪采集不同抗体(或抗原)浓度下受测分子的荧光自相关曲线,对采集的荧光自相关曲线分别进行拟合得到不同抗体浓度下微观体积内荧光标记的结合抗原(或抗体)和总抗原(或总抗体)分子个数的比值(Fb),通过对不同抗体(或抗原)浓度下Fb值进行拟合可以得到抗原-抗体的解离常数[14]。
在抗原-抗体亲和力检测的过程中,抗体(或抗原)浓度的增加会同时影响到抗原和抗体结合比例(Fb)和受测分子的特征扩散相关时间。特征扩散相关时间反映的是受测分子在溶液中的动态(翻滚、平移等)体积。假设混合溶液中荧光标记的抗原分子的总数固定,随着抗体浓度的增加,更多游离抗原和抗体结合形成质量(体积)更大的抗原-抗体结合物即结合态抗原。当受测分子因布朗运动通过微观检测体积时,结合态抗原的质量(体积)比游离抗原越大,它的扩散速度就越慢,在检测体积内的停留时间也越长,特征扩散相关时间的值也会越大。因此,受测分子的特征扩散相关时间反映了受测荧光分子的状态(游离态、结合态)和抗原-抗体结合程度,但这种方法并未普遍用于抗原抗体亲和力检测。
本文在传统FCS技术的基础上提出一种新的检测抗原抗体亲和力的方法,实验分别以Alexa Fluor647荧光分子抗原(分子量为1250)和Cy5抗体(分子量为150 kDa,1 Da=1 u),绿色荧光蛋白(GFP)抗原(分子量为27 kDa)和抗体(分子量为150 kDa)为研究对象。利用荧光相关光谱仪[15]采集不同抗体浓度下抗原分子的荧光自相关信号,将传统FCS技术结合最大熵方法(MEM)对采集的自相关信号进行分析。利用传统FCS技术计算抗原抗体解离常数;利用MEM方法计算不同抗体浓度下混合溶液中荧光标记抗原分子的特征扩散时间的分布曲线。通过比较特征扩散时间分布曲线随抗体浓度的变化可以对抗原抗体结合程度进行评估。实验结果证实,FCS技术结合MEM方法可以实现对抗原抗体亲和力的简便、快速、灵敏检测;自主开发的模块化数据分析软件简化操作流程,进一步提高数据分析的准确性和可重复性。
2 基本原理
2.1 FCS技术的基本原理
FCS技术具有较高的检测灵敏度。FCS技术在溶液样品中分离出一个很小的荧光激发和检测体积,通常包含几个至几百个基于布朗运动而自由扩散的荧光分子或经过荧光标记的分子。受测溶液的浓度越低(pM),微观体积内的荧光分子越少。因此,当微观体积内荧光分子或荧光标记的分子因布朗运动或者化学反应通过检测体积时,荧光信号会出现随时间涨落的现象。FCS技术就是通过分析荧光信号涨落的相关函数而获取溶液中受测分子的分子大小、浓度等。
荧光自相关光谱是最早开发的FCS技术。它通过计算荧光信号F(t)与自身在相关时间τ的时滞信号F(t+τ)之间的重叠程度,即自相关幅度G(τ),进而获得受测分子水动力学特性的方法。自相关幅度G(τ)定义为
式中:δF(t)反映荧光信号F(t)随时间的波动;δF(t)=F(t)-<F(t)>,尖括号代表时间平均值。当相关时间τ=0时,自相关幅度G(0)为最大值且G(0)=1/N,N是微观体积内平均荧光分子个数;当相关时间τ>0时,两组信号F(t)与F(t+τ)之间的重叠区域<δF(t)δF(t+τ)>随τ值的增加而减少,自相关幅度G(τ)下降;当相关时间τ→¥时,两组信号之间无重叠区域,自相关幅度G(¥)=0。因此,随相关时间τ增长,自相关幅度G(τ)逐渐衰减。
运用特定数学模型对荧光自相关数据G(τ)进行拟合,可获得受测荧光分子的多项水动力学特性,其中较为重要的参数包括微观体积内平均荧光分子个数(N)、平均分子荧光亮度(λ)和受测分子的特征扩散相关时间(τD)。荧光信号的波动幅度受检测体积内平均荧光分子个数和平均分子荧光亮度的影响。特征扩散相关时间(τD)受检测体积内受测荧光分子的质量/体积的影响,质量/体积越大的受测分子在检测体积内扩散时间越长。
2.2 FCS技术计算抗原抗体解离常数
传统FCS技术计算抗原抗体解离常数,首先需要分别检测和分析抗原溶液、抗原抗体完全结合溶液(无游离抗原),以获取游离抗原和抗原抗体复合物的特征扩散相关时间和平均分子荧光亮度;然后检测不同浓度比例的抗原与抗体混合液,分别计算不同抗体浓度下结合抗原与总抗原分子个数的比值(Fb);最后,对不同抗体浓度下Fb值进行拟合获得抗原抗体解离参数。
2.2.1 设备校准
在正式实验之前,首先需要使用已知扩散系数的标准荧光分子溶液对FCS设备进行校准,以确定当前状态下设备的检测体积的形状参数(S)。S=z0/r0,假设检测体积中心处激发光的光强为I0,z0和r0是检测体积内激发光强度为I0/e处分别沿Z轴或X(Y)轴距离检测体积中心点的距离,e为自然常数。对FCS设备采集的标准荧光分子的自相关曲线进行拟合可获取S值。
式中:N=1/G(0);T为检测体积内处于三重态的荧光分子(弛豫时间为τT)的比例。
根据(2)式拟合得到的参数N、τD和S值,可以计算出仪器的聚焦体积V。
根据S和V值可以确定设备当前的工作状态,其中D为受测分子的扩散系数。参数S的理论值为2~3左右,若FCS设备的荧光激发和检测光路工作良好,S的实际测量值应该小于10;另外,S值的测量可重复性反映仪器工作状态的稳定性。参数V的实际测量值一般在1~2 fL,说明设备聚焦状态较好。在后续实验的数据分析中,参数S值和V值固定。
2.2.2 分析游离抗原溶液、抗原抗体完全结合溶液
无论是游离抗原溶液还是抗原抗体完全结合溶液,受测样品中荧光分子只存在一种状态(单组分)。游离抗原溶液中不存在抗原抗体结合物,只存在游离的抗原分子;而抗原抗体完全结合溶液中只有结合态抗原。通过(2)式分别对上述两种溶液的自相关曲线进行拟合,可以得到游离抗原和抗原抗体结合物的特征扩散相关时间(τL和τLS),以及它们各自的平均分子荧光亮度(λL和λLS)。平均分子荧光亮度(λ)是每个受测荧光分子每秒发射的光子数,即平均荧光强度<F(t)>与检测体积内平均荧光分子个数N的比值。
2.2.3 分析不同浓度比例的抗原抗体混合溶液
不同浓度比例的抗原和抗体混合溶液中荧光分子存在两种状态(多组分),分别是荧光标记的游离抗原和结合态的抗原抗体结合物。利用下式对不同抗体浓度(M)下的抗原抗体混合液的自相关曲线GM(τ)进行拟合,称为多组分FCS分析。
式中:游离抗原和抗原抗体结合物的特征扩散相关时间(τL和τLS)和荧光亮度(λL和λLS)已经通过检测抗原溶液和抗原抗体完全结合溶液获取。利用(6)式分别对不同抗体浓度下的抗原抗体混合溶液的自相关曲线进行拟合得到参数
通过下式可得出不同抗体浓度(M)下,混合溶液中结合抗原分子个数(
2.2.4 计算抗原抗体的解离常数
对抗原抗体混合溶液,不同抗体浓度(M)下的
式中:B为常数;p为比例因子。
2.3 MEM方法分析混合溶液中抗原抗体结合
在抗原和抗体混合溶液中,抗体浓度越高,处于结合态的荧光标记物越多,而游离态分子越少。这种变化会直接影响到受测分子τD值的分布,因为抗原结合抗体后,受测荧光标记物的质量(体积)增大,在检测体积内的扩散速度变慢会使τD值增加。因此,利用MEM方法拟合不同抗体浓度(M)下的荧光自相关曲线GM(τ)可以得到受测分子τD值的分布曲线,进而获得当前溶液中抗原分子的状态,以及抗原和抗体的结合程度。
与传统FCS方法不同,MEM分析无需预先了解溶液组成成份和荧光分子的状态。假设待测溶液中有m种不存在相互作用的荧光标记的分子,每种荧光分子的三重态相同,而扩散系数不同。因此,FCS拟合公式转变为
式中:每种受测分子的特征扩散相关时间为
模型函数计算的拟合曲线与实验测得的自相关曲线的误差
式中:
使用MEM方法控制拟合过程,熵HM定义为
为同时保证拟合误差
式中:参数αM是正则化因子,用于调整
实验中正则系数αM设置初始值为20000,τD的拟合区间为0.01~ 5 ms,共设置51~150个τD采样点,每个采样点之间取均一的对数间隔。MEM拟合完成后,为对比不同抗体浓度(M)下受测分子的
式中:max
3 实验
3.1 FCS仪器
实验使用CorTectorTM SX100(广东中科奥辉科技有限公司)采集FCS数据。设备的光路结构如
3.2 样品制备
抗原抗体亲和力实验所用样品包括Alexa Fluor647 carboxylic acid(Thermo Fisher,美国),小鼠抗Cy5单克隆抗体(C1117, Sigma-Aldrich,美国),GFP荧光蛋白抗原抗体亲和力实验所用样品包括Recombiant eGFP(P7410,Beyotime,中国),兔抗GFP 单克隆抗体(AF1483, Beyotime, 中国)。10 nM(1 nM=1 nmol/L)的ATTO655(AD655-21,ATTO-TEC GmbH,德国)和5 nM的ATTO488(AD488-21,ATTO-TEC GmbH,德国)用于实验开始前的FCS设备的光路校准。所有样品购买后均在-20 ℃保存,待使用时取出在4 ℃融化并按照需求进行稀释。除ATTO488和ATTO655使用超纯水(HPLC grade,187553,百灵威,中国)稀释外,其他样品稀释和配制抗原-抗体混合溶液均使用100 mM PBS缓冲液(pH 7.4)。抗原-抗体解离常数的检测要求抗体的浓度在荧光抗原浓度的10-3~104倍数内变化[10,16-18]。Alexa Fluor647抗原溶液(100 pM)与不同浓度的鼠抗Cy5单克隆抗体(10 pM~300 nM)混合,4 ℃孵育30 min使抗原抗体充分结合反应后,直接在FCS设备上检测。混合溶液中抗体浓度设置为13组,分别为0, 10 pM, 50 pM, 100 pM, 500 pM, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 160 nM, 200 nM, 250 nM和300 nM。GFP抗原溶液(200 pM)与不同浓度的兔抗GFP单克隆抗体(230 pM到920 nM)充分混合后检测。混合溶液中抗体浓度设置为15组,分别为0,230 pM,460 pM,690 pM,2.3 nM,6.9 nM,11.5 nM,23 nM,69 nM,115nM,189 nM,230 nM,460 nM,690 nM和920 nM。
3.3 数据采集
本文使用已知扩散系数的5 nM ATTO488溶液和10 nM ATTO655溶液为标准品对488 nm和638 nm光路进行校准,通过对采集的数据进行拟合[(2)式]确定当前状态下激发体积(V)和形状参数(S)。利用FCS数据采集软件采集每个受测样品的荧光自相关数据,重复检测10次,每次采样时间为10 s。
3.4 抗原抗体亲和力数据分析流程
为规范化和简便化利用FCS设备分析抗原抗体亲和力,我们自主开发一款基于荧光相关光谱技术进行分子间相互作用的数据分析软件(Molecular Interaction)。按照软件的分析流程导入样品的实验数据,完成以下五步即可得到抗原-抗体解离常数KD。具体过程是:1)导入标准荧光分子的FCS自相关数据,计算参数。2)将采集到的以下三种溶液的FCS自相关数据依次导入,分别是游离抗原溶液、抗原-抗体完全结合的溶液和抗原-抗体按不同比例混合的溶液。软件按照上述分析流程分别计算不同抗体浓度(M)下抗原-抗体结合比例
图 2. 抗原抗体亲和力分析软件的流程示意图
Fig. 2. Flow chart of the data analysis software for determining antigen-antibody binding affinity
4 结果与讨论
4.1 分析Alexa Fluor647荧光分子抗原与抗体亲和力
4.1.1 设备校准
在正式实验开始前,首先需要使用已知扩散系数的标准荧光分子溶液(10 nM ATTO655)对FCS设备进行校准,以确定当前状态下FCS设备聚焦体积的形状参数(S)和体积(V)。拟合ATTO655的自相关曲线[
4.1.2 分析游离抗原溶液、抗原抗体完全结合溶液
对游离抗原溶液[100 pM,
4.1.3 分析不同浓度比例的抗原-抗体混合溶液
随着混合溶液中抗体浓度从0~300 nM不断改变,抗原和不同浓度抗体的混合溶液的归一化自相关曲线随着抗体浓度增加而逐渐右移,受测荧光分子的特征扩散相关时间(τD)也逐渐增大[
为获取溶液中荧光标记的抗原分子的特征扩散相关时间(τD)分布曲线,我们用MEM方法分别拟合不同抗体浓度(M:0~300 nM)下采集的13条自相关曲线。分析结果如
图 3. FCS和MEM方法分析Alex647荧光分子抗原抗体亲和力。(a)标准荧光分子溶液、游离Alexa Fluor647抗原溶液以及饱和抗原-抗体混合溶液的归一化自相关曲线;(b)Alexa Fluor647抗原和不同浓度抗体混合溶液的归一化自相关曲线;(c)利用MEM方法对采集的13组游离抗原和抗原抗体混合溶液的自相关曲线进行分析,得到溶液中抗原的特征扩散相关时间分布曲线;(d)对不同抗体浓度下抗原-抗体结合比例进行非线性最小二乘拟合得到抗原抗体的解离常数
Fig. 3. Analyze the affinity of Alex647 fluorescent molecule antigen and antibody using FCS and MEM methods. (a) Normalized fluorescence auto-correlation curves of a standard fluorescent molecule sample, a free Alexa Fluor647 antigen sample, and a bound antigen sample; (b) normalized fluorescence auto-correlation curves of Alexa Fluor647 mixed with different concentrations of monoclonal antibody; (c) distribution curves of diffusion correlation time of the free and bound Alexa Fluor647 obtained by MEM analyses of the 13 antigen-antibody samples; (d) antigen-antibody dissociation constant was obtained by non-linear least squares fitting of the bound antigen fractions data with different concentrations of antibody
4.1.4 计算抗原抗体解离常数
对不同抗体浓度(M:0.01~300 nM)下结合抗原与总抗原分子比值(Fb)进行拟合可以得到溶液中抗原抗体的解离常数KD为0.746 nM±0.037 nM[(9)式]。拟合结果如
4.2 分析GFP荧光蛋白抗原与抗体亲和力
4.2.1 设备校准
在正式实验开始前,首先需要使用已知扩散系数的标准荧光分子溶液(5 nM ATTO488)对FCS设备进行校准,以确定当前状态下FCS设备聚焦体积的形状参数(S)和体积(V)。拟合ATTO488的自相关曲线[
4.2.2 分析不同浓度比例的抗原抗体混合溶液
对游离抗原溶液[200 pM,
4.2.3 分析不同浓度比例的抗原-抗体混合溶液
随着抗体浓度逐渐增加(0~920 nM),GFP抗原(200 pM)和不同浓度抗体混合液的归一化自相关曲线逐渐右移,受测荧光分子的特征扩散相关时间(τD)也逐渐增大[
图 4. FCS和MEM分析GFP荧光蛋白抗原和抗体亲和力。(a)标准荧光分子溶液、游离GFP抗原溶液以及饱和抗原-抗体混合溶液的归一化自相关曲线;(b)GFP抗原和不同浓度抗体混合溶液的归一化自相关曲线;(c)利用MEM方法对采集的游离抗原和抗原-抗体混合溶液的自相关曲线进行分析,得到溶液中抗原的特征扩散相关时间分布曲线;(d)对不同抗体浓度下抗原抗体结合比例进行非线性最小二乘拟合得到抗原-抗体的解离常数
Fig. 4. FCS and MEM Analyses of GFP antigen-antibody binding affinity. (a)Normalized fluorescence auto-correlation curves of a standard fluorescent molecule sample, a free GFP antigen sample, and a bound antigen sample; (b) normalized fluorescence auto-correlation curves of samples composed of GFP mixed with different concentrations of monoclonal antibody; (c) distribution curves of diffusion correlation time of the free and bound GFP obtained by MEM analyses of the antigen-antibody samples; (d) antigen-antibody dissociation constant was obtained by non-linear least squares fitting of the bound antigen fractions data with different concentrations of antibody
4.2.4 计算抗原抗体解离常数
如
4.3 FCS与其他生物分子亲和力检测技术对比
初步实验结果表明,FCS是一种简单、高效的研究免疫反应的工具,具有样品用量小,背景噪声低等优势。模块化设计的相互作用分析软件保证抗原抗体亲和力检测的快速、灵敏和可重复性。将FCS与生物医学领域中常用的研究生物分子亲和力的技术(等温滴定量热法(ITC)、表面等离子共振技术(SPR)和微量热涌动技术(MST)进行对比(
表 1. FCS与其他生物分子亲和力检测技术对比
Table 1. Comparison of FCS with other technologies for quantitatively determining antigen-antibody binding affinity
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除ITC外,其他三种均属于光学检测技术,其中基于荧光技术的MST和FCS的灵敏度最高。虽然四种技术均可以用于检测生物分子亲和力,以及分子结合反应的解离常数和热力学/动力学常数,但是在样品制备、检测时间等方面存在差异。
1) 样品制备。ITC无需对受测分子进行化学修饰或荧光标记,但需要大量纯化样品且对抗体浓度要求也最高;但仪器和耗材费用较低。SPR需要检测相互作用分子对的一方通过化学修饰固定在纳米金膜或玻璃表面,且仪器和耗材价格较高。FCS和MST均需要对受测分子进行特异性荧光标记,因此荧光分子溶液、细胞裂解液等复杂生物溶液均可作为检测的反应体系。但是MST要求样品在检测过程中尽量不出现聚集,而FCS对此没有要求,FCS通过样品的荧光亮度和特征扩散系数,可以对样品中受测分子的聚集状态进行分析。
2) 样品用量。ITC样品用量最高,FCS用量最少仅需要几十微升。
3) 检测时间。ITC检测时间最长2~2.5 h,而其他三种方法均可在几十秒到数分钟完成抗原抗体亲和力检测。
4) 灵敏度。SPR不适用于小分子的相互作用研究,因为无法产生足够大的折光系数变化。FCS对样品浓度要求最低,可以检测pM~nM浓度的样品,且检测灵敏度最高(~10-12 M)。FCS可以定量分析受测分子的绝对浓度和流体动力学半径,根据单个分子的荧光变化情况计算样品浓度,以及荧光标记的生物分子大小等信息。但MST无法检测单个分子的荧光变化情况。
综合以上对比,FCS技术在生物检测、生物与医学研究、药物研发、临床诊断、食品以及环境分析等方面具有广阔的应用前景。
本实验也证明FCS可以方便地用于抗原与免疫复合物的鉴别,实现抗原抗体之间亲和力的简便快速检测,但是也存在局限性。在FCS分析中为了区分受测溶液中处于结合态(结合抗原)和未结合态(游离抗原)荧光标记物,理论上要求这两种组分的扩散系数需相差至少1.6倍,即分子量比要大于4,才能使检测这两种组分的自相关曲线有明显差异[27]。因此,为验证算法性能,我们选择两种结合态和游离态抗原的分子量之比相差较大的样品。其中,Alexa 647抗原结合态和游离态的分子量之比为120(151 kDa/1250),GFP抗原结合态和游离态的分子量之比仅为6.5(177 kDa/27 kDa)。对两种样品的数据分析结果显示当抗原浓度固定,随着抗体浓度的增加,抗原-抗体的结合比例也逐渐增加,导致抗原的τD值增大,FCS自相关曲线逐渐右移直至抗原-抗体的结合达到饱和。对不同抗体浓度下得到的抗原抗体结合比值进行拟合,可以得到溶液中抗原抗体免疫反应的解离常数。MEM拟合得到的抗原分子的τD分布曲线也反映出抗原-抗体结合程度随抗体浓度的变化。而在实际应用中,天然抗原分子量通常大于200 kDa,而一般抗体分子量为150 kDa。因此,当抗原抗体分子量比值不高于理论值(<4)时,FCS自相关技术无法有效测出抗原-抗体亲和力。下一步我们会继续探讨在这种情况下,如何对抗原和抗体间亲和力进行定性和定量检测,例如开展荧光互相关技术(FCCS)在此领域的应用[15];同时我们会进一步优化MEM分析算法的性能。
5 结论
本文在荧光相关光谱技术的基础上,实现对抗原抗体之间亲和力的简便快速检测。以Alexa647荧光分子和GFP荧光蛋白抗原及抗体反应为研究对象,对测得的自相关数据进行数学模型的拟合得出解离常数,继而对抗原抗体亲和力强弱进行评估;使用MEM方法对抗原抗体混合溶液的自相关曲线进行分析,可以获取不同抗体浓度下混合溶液中不同组分(游离抗原和结合抗原)的特征扩散相关时间分布,实现对溶液中抗原抗体结合过程的评估。针对实验分析过程中遇到的问题,例如数据导入、数学模型拟合等,我们自主设计开发一款简便使用的软件(Molecular Interaction)以提高数据分析的准确性和可重复性。在现有工作的基础上,下阶段将着重解决在抗原与抗体分子量相当的情况下,如何检测抗原抗体亲和力。
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