1 引言

细胞内外生物大分子间的相互作用是细胞参与生命活动的基础,只有理解细胞生命过程中分子机制的交互作用才能更深入地了解生命活动的本质^[1]。随着人们对细胞内蛋白质等生物大分子功能的探索研究,利用离体表征方式已经无法满足研究需求,这主要是由于脱离了实际微环境,细胞检测很难反映细胞内部真实的相互运作的关系,不利于信息的提取。因此,对活细胞成像方法的研究是揭秘细胞内分子运转以及亚细胞结构变化必不可少的工具^[2]。

由于细胞内大分子处于纳米级别,因此对于成像的分辨率要求非常高^[3]。目前可用于细胞成像的纳米分辨方法已有多种,比如随机光学重建显微、受激发射损耗显微成像、结构光照明显微成像等^[4-6],这些方法可以将分辨率提高到几十纳米,这对于活细胞成像而言至关重要。而在此基础上,由于其轴向深度不够,扫描时间过长等问题限制了活体细胞的实时监测,因此对于理解活细胞内分子间的交互作用以及分子的动态追踪而言具有很大局限性^[7],由此发展了多种具有轴向分辨能力的方法,如柱面镜像散、双焦面成像、双螺旋点扩展函数法、荧光干涉方法等^[8-11],这些方法可以很大程度地提高轴向分辨率,进一步推动了细胞三维成像的发展。

三维成像方法突飞猛进,实现厚度达到10 μm的完整活细胞探测也有了一定的进展,比如基于多焦面衍射光栅方法的多焦面成像(MFM)技术,通过引入一个特殊设计的光学元件—多焦面衍射光栅(MFG)将样品分割为N×N个图像阵列,通常分割为9等份,但因此成像范围会缩小,分光后光能利用率太低。而另一种MFM方法则是利用多个成像探测器来完成,成本太高,系统过于复杂。因此这些方法不能完全满足现实要求^[12-13]。

为了满足生物学家研究完整细胞内的动态状态以及胞内分子间交互作用的需求,自主设计和搭建了基于双螺旋点扩展函数(DH-PSF)与变形光栅DG相结合的三维动态追踪荧光成像DDC-FT系统。该方法利用双螺旋点扩展函数的三维纳米定位能力以及变形光栅扩展景深的能力,不需要扫描层析即可实时获取轴向12 μm深度的动态分子的三维空间信息,该精度在目前的成像系统当中都是非常少见的。

2 DDC-FT系统原理

双螺旋点扩展函数基于自成像原理,通过拉盖尔-高斯(LG)模式的特定排序叠加所获得,具有随离轴发生连续旋转且模式不变的特性^[14-15]。该函数利用相位变换将点扩展函数变换成两个围绕光轴旋转的旁瓣,通过旁瓣的旋转角度和相对位置信息计算得到相应的三维位置信息,使得三维成像具有纳米级的定位能力^[16-18]。

而变形光栅-^[19-20]本质上就是离轴的二元菲涅耳波带片,它同时具有普通光栅的分光效果以及菲涅耳波带片聚焦的能力,使得入射光发生衍射后按照不同衍射级分束传播和聚焦,将不同轴向深度的信息进行分割后同时并行成像到同一个像面,具有扩展景深的能力。

通过将上述方法进行相位函数级联和优化,获得了同时具有DH-PSF和DG功能的复合型相位函数,即φ=φ_DG+φ_DH,所形成的相位模式具有DH-PSF和DG的双重特性,即同时具有DH-PSF三维纳米定位的能力和DG扩展景深的能力。前期工作中已经实现了该相位模板的理论设计与研制^[16,21-23]。按照具体的成像深度进行设计,其中DH-PSF的三维成像范围设定为4 μm;结合变形光栅,将厚样品按照0级和±1级衍射级次分层,并同时成像于同一个像面上的不同横向位置,成像系统的有效景深扩展至传统的3倍,每一个级次经过DH-PSF效应实现高精度定位,最终形成具有12 μm成像深度的高精度探测,如图1所示。

利用所制备的复合相位片搭建成像系统,其设计参数如下:成像系统通过Olympus 81×显微镜实现,其中浸油物镜数值孔径为1.4,放大倍数为100;激发光波长为488 nm。激光光束经过扩束准直光路后由物镜激发样品产生荧光,由物镜收集后经过管镜TL2(焦距f_TL2=180 mm),然后再通过一组4f系统,其中复合型相位片放置于傅里叶面位置,最终信号经过4f系统成像到探测器(EMCCD)(DU897, Andor公司,美国)上,如图1(a)所示。其中图1(c)所示为12 μm成像深度下的荧光微球成像结果,按照变形光栅的分层形成三级次并行显示4 μm成像空间,每一个级次利用DH-PSF获得三维空间定位。

首先对系统进行标定以获得该系统的定位精度信息。利用100 nm荧光微球(T8872,ThermoFisher公司, 美国)作为标准具进行标定实验,激发光波长为488 nm,发射光波长为560 nm,发射谱宽为30 nm,探测器曝光时间为30 ms,增益为10。将三维纳米位移台固定在显微镜载物台上,荧光微球通过纳米位移台进行高精度位移,同时纳米位移台与探测器相结合,通过位移台的步进触发探测器进行曝光采集,如图1(c)所示。每一个步进位置采集100幅,步进量设定为100 nm,由此得到不同级次上的荧光信号。步进量与荧光微球成像所形成的双螺旋点的旋转角度一一对应,通过拟合可以获得轴向位置与角度相应的标定曲线,如图1(d)所示。

图 1. (a) DDC-FT动态追踪成像系统图;(b)复合相位片模拟结果及光刻制版结果;(c)荧光微球成像显示图;(d)不同级次下荧光信号经过系统形成的双螺旋点旋转角度随z轴连续移动的对应曲线

Fig. 1. (a) Schematic diagram of DDC-FT system; (b) simulational image of the composite phase plate and image of photolithography plate; (c) images of fluo-spheres; (d) calibration curves of DH-PSF rotating angle versus the depth of the sample for the 0th and the ±1st diffraction orders

下载图片 查看所有图片

相同曝光条件下,同时不同级次中各轴向位置处(x,y,z)所对应的定位精度如图2所示,在30 ms曝光时间下,荧光微球移动到0级和±1级空间旋转角度为0位置处时总光子数分别为4100和3500。0级位置的精度要高于±1级,这是由于变形光栅的衍射效率所引起。计算得到所对应级次的平均定位精度(单位为nm)分别为σ_-1st(x,y,z)=(6.5,9.2,23.4),σ_0th(x,y,z)=(3.7,2.8,10.3),σ_+1st(x,y,z)=(5.8,6.9,18.4)。当0级总光子数降低到1000时,0级位置的定位精度分别会降低到(20,28,48)。系统定位精度和理论定位精度之间的差异,主要来自样品台在成像过程中的微小漂移及系统噪声。

图 2. DDC-FT系统定位精度标定

Fig. 2. Localization precision calibration of DDC-FT system

下载图片 查看所有图片

为进一步验证成像方法适用于动态追踪实验,利用三维纳米位移台设计追踪模型,验证动态追踪的精确度。同样利用100 nm荧光微球作为样品并固定,以纳米位移台为载体,通过程序写入既定轨迹曲线控制纳米位移台,进而带动荧光微球按照指定轨迹移动,同时进行步进相机的采集。纳米位移台的移动轨迹按照直角坐标系定义参数{100t,100t,100t},步进的起始位置需通过双螺旋图像来确定,因此对纳米位移台(x,y,z)总步进量的设置需要大于成像范围,程序设定为14 μm,样品随位移台移动,时间t随相机的采集频率而定。为了避免纳米位移台步进中发生抖动引起采集数据产生偏差,每一组步进位置采集5幅,以中间数据作为结果,得到不同时序的动态图像,如图3所示。图3(a)所示为不同时序下荧光微球采集图像,上排为样品在-1级次位置处的运动轨迹,随三轴方向逐步移动,x、y为平面运动,z轴由图像显示为双螺旋形式。荧光微球在-1级移动4 μm量程时双螺旋点旋转180°,继而在0级位置显示,依次旋转180°后在1级位置显示并移动,整个过程通过相机同步记录和存储。采集数据处理结果如图3(b)和图3(c)所示,其中红色线条表示样品台轨迹移动的原始路线,蓝色点表示荧光微球沿轨迹移动获得图像并重构后所得到的结果。计算结果显示与既定轨迹匹配,标准差为0.014 μm,成像深度满足理论计算的12 μm轴向范围。该实验验证了系统的准确性,证明了能够将其用于实际的活细胞动态追踪实验中。

图 3. 荧光微球移动轨迹。(a)不同时刻的采集图像;(b)荧光微球的程序给定轨迹和实际轨迹;(c)截取轨迹部分的图像对比

Fig. 3. Track of the fluo-spheres. (a) Images captured at different time; (b) tracks of the fluo-spheres (the designed track is red and the captured track is blue); (c) zoom in the red box area in Fig.(b)

下载图片 查看所有图片

3 实验结果

根据上述结果将系统应用于活细胞的实时监测当中。实验对象为巨噬细胞。巨噬细胞属于免疫细胞,具有免疫调节的作用,可通过吞噬杀灭微生物。当细胞遇到外源异物时所触发的生物信号能使其在异物局部形成板状伪足将其包围,巨噬细胞表面膜发生内陷,可摄入异物到细胞后形成吞噬体,在动力蛋白作用下吞噬体与溶酶体靠近并融合,异物在胞内被杀灭和分解,而最终不能消化的病原或者异物则通过胞吐作用被排出胞外。实验将通过动态系统实时观测巨噬细胞的内吞过程。

实验系统以倒置荧光显微镜(IX81,OLYMPUS公司,日本)为基础,物镜放大倍率为100,数值孔径为1.4;激发波长为488 nm,发射波长为为560 nm;探测器采用EMCCD,其有效像元大小为16 μm,制冷温度为-80 ℃。源图像采集时,单幅曝光时间为40 ms,使用40 nm荧光微球作为标记物来观察巨噬细胞的内吞过程。为了精确控制荧光微球的内吞时间,采用温控方式改变细胞的活性,先在10 ℃下让细胞处于休眠状态,将稀释的荧光微球加入培液让其布朗扩散,微球贴附在细胞上又不发生内吞,细胞冷却5 min后换液,去除培液悬浮的荧光微球,重新加入培液后成像,成像过程中样品台保持37 ℃,以保证细胞的活性状态,每个细胞成像时间约20 min。

DDC-FT系统的成像结果如图4所示。图4(a)图像是白光照明下巨噬细胞的轮廓,说明细胞状态良好;图4(b)是暗场情况下巨噬细胞的荧光图像,此时荧光分子被激发后成像,并按照不同的成像深度同时显示在探测器的不同区域,由图像可以看出在不同的轴向范围内均有荧光分子发光;图4(c)即为探测器采集1000幅图像后重构得到的三维轨迹图,采集时间为3 min,将重构后的荧光分子坐标位置按照时序进行标注,得到不同时序下荧光分子的轨迹路线;在图4(b)中用箭头指示不同位置处的荧光微球,与图4(c)对应颜色箭头所指示的轨迹一一对应,其中用黄色框图框出红色箭头标记的荧光微球进行放大,经过图像处理后得到该微球的大范围运动轨迹,如图4(d)所示,能够清晰查看到该荧光微球的运动情况,通过数据分析得到荧光微球在细胞内的平均运动速率为1 μm·s^-1,最大速率为3 μm·s^-1。从实验结果不难得出,显微成像系统实现了将3个不同深度的空间信息同时呈现在同一平面上,每个平面具有4 μm景深的成像深度,结合变形光栅景深达到12 μm。该系统成功实现了活细胞内的三维纳米精度的分子追踪,为研究厚样品三维纳米精度的单粒子追踪和定位提供了便利条件。

图 4. 巨噬细胞的动态追踪成像。(a)白光照明下巨噬细胞的轮廓;(b)暗场情况下巨噬细胞的荧光图像;(c)重构得到的三维轨迹图;(d)放大(c)黄色方框

Fig. 4. Dynamic tracking of macrophage. (a) Profile of macrophage under white light illumination; (b) fluorescent image of macrophage; (c) dynamic tracking reconstruction of fluo-spheres; (d) zoom in the yellow box area in Fig.(c)

下载图片 查看所有图片

4 结论

设计具有高定位精度的三维动态追踪成像系统来实现目前暂未解决的全细胞内多粒子动态追踪的问题。利用双螺旋点扩展函数的三维纳米定位能力实现4 μm的三维小范围空间的高精度定位,同时结合变形光栅的分层成像方式,能够将成像深度扩展到3倍即达到12 μm的成像深度,能够实现完整细胞内荧光分子的动态追踪探测。通过实验验证了系统的定位精度以及所能达到的成像深度,与理论设计相吻合,验证了该方法的可行性;同时初步对巨噬细胞内吞行为进行动态追踪成像,利用荧光微球实现在细胞内的动态捕捉,并最终利用重构算法获得在细胞内粒子的运动轨迹以及在细胞内的动态细节,数据分析可以获取荧光微球在细胞内的运动速率以及运动量,对研究细胞内部作用关系的变化差异、细胞衰老等问题提供便利的手段,为研究其他各项生命活动和癌细胞的药理研究等工作奠定一定基础。