荧光分子层析成像图像重建研究进展 
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1 引言
荧光分子层析(FMT)成像是一种具有深度分辨能力的宏观光学成像技术,能够无损地定位和量化荧光探针在生物组织中的分布[1-2]。与共聚焦显微成像、双光子显微成像等光学分子成像技术相比,FMT成像的视场范围大、成像深度深,几乎可对小动物体内任何部位的荧光探针进行活体成像[3]。与传统的用于小动物成像的微型磁共振成像(MicroMRI)、微型X射线计算机断层成像(MicroCT)、微型正电子发射断层成像(MicroPET)相比,FMT具有无辐射、成本低、灵敏度高等优点。因此,FMT的成像优势使其在蛋白质相互作用研究、药物作用机制解析以及肿瘤治疗效果评价等方面具有巨大的应用潜力[4-10]。
FMT成像是利用特定波长的激光束激发生物体内具有特异性的荧光探针,并利用探测器探测组织表面的激发光和荧光信号,最后通过图像重建方法重建出荧光探针在生物体内的三维分布。图像重建涉及到两个相互关联的问题:正向问题和逆向问题。正向问题是指已知生物体组织光学参数和荧光探针的分布,求解激发光和荧光光强的分布;逆向问题是指已知成像生物体表面激发光和荧光光强的分布以及组织光学参数,重建出生物体内荧光探针的分布[11]。FMT成像的物理本质是基于扩散光子的成像,其相邻的投影图相似度高,且测量的光学信号不完整,因此其逆向问题具有高度病态性[12-13]。病态性高意味着图像重建过程对噪声以及各种数值误差非常敏感,抗噪声能力很差。要获得良好的图像重建结果,除了尽可能提升成像系统的性能,例如采用性能好的电子倍增CCD以提高信噪比,研发适于大浓度差异的高动态范围成像方法[14]等来降低测量噪声外,还主要取决于两个方面:一是提高正向问题求解的精度以降低数值误差;二是克服和缓解逆向问题的病态性以增强其抗噪声能力。前者属于“止源”,后者属于“改善”。本文将从这两个方面出发,介绍目前FMT图像重建的研究进展。
2 正向问题
FMT正向问题的理论基础是辐射传输理论,可用玻尔兹曼辐射传输方程(RTE)来描述[15-18]。虽然RTE可以精确地描述扩散光子在组织中的传输过程,但是由于RTE所具有的局限性及生物组织辐射的复杂性,正向模型可针对具体问题采用具有不同近似程度的确定性模型和基于统计的随机模型。正向问题的求解精度主要取决正向模型本身的精度、数值求解方法的精度、模型中作为已知量的组织光学参数的准确性。下面将逐一介绍确定性模型及其数值求解、普遍采用的蒙特卡罗(MC)随机模型,以及提高组织光学参数建模准确性的方法。
2.1 确定性模型及其求解
确定性模型是对RTE的近似:一类是物理近似,如忽略吸收、散射,或取某些极限情况等;另一类是利用数学近似的方法,如对空间或方向分布采用不同的离散近似方法,或采用函数近似逼近的方法。在基于扩散光子的成像模型中,一般采用球谐函数法(P
确定性模型的求解方法主要是解析法和数值法。解析法主要适用于均匀介质和具有规则几何形状 (如无限大、半无限、球体、圆柱等少数特殊情形)的组织。数值法主要适用于光学异质性强和具有不规则几何形状的组织,其适用性强,应用广泛。目前
表 1. 用于FMT成像的几种确定性模型的比较
Table 1. Comparisons of several deterministic models used in FMT
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常用的数值解法包括有限差分法(FDM)[21]、边界元法(BEM)[31]、有限体积法(FVM)[32]、有限元法(FEM)[33-34]等。FDM的主要思想是利用差分算子替代方程中的微分算子,从而可以对微分算子进行近似处理,但差分算子替代微分算子的过程中引入了离散误差或截断误差。FDM具有求解过程简单、灵活、通用性强等优势,但是无法很好地处理复杂、不规则的几何形状。BEM首先构建定义域边界上的积分方程,然后对定义域边界进行剖分,在剖分单元上将积分方程离散化,然后把原问题变换成为一个代数方程组的求解。BEM的优势在于仅需剖分边界,无需剖分整个定义域,从而减少了单元数量,提高了计算效率。但是对于FMT成像,随着成像对象内部组织边界的增多,边界元法需要构建多个耦合的边界积分方程,所以求解复杂度会大幅增加,降低了求解效率。FVM首先将求解域离散化为一系列控制体积,并使每个网格点周围有一个控制体积;然后将待求解的微分方程对每一个控制体积进行积分,就可以得到一组离散方程。FVM的优点是可以比较精确地模拟各种复杂曲线或曲面边界,网格的划分较为随意,可以统一处理多种边界条件,离散方程的形式规范,积分方程中每一项都具有明确的物理意义,从而可以对各个离散项给出一定的物理解释,但其求解过程相对复杂,不易提高求解的精度。FEM是将原问题的求解域离散化为有限单元组成的集合(有限元网格),然后构建单元上的插值函数,将原方程中的场变量在每个单元上表示为插值函数的线性组合,接下来按照泛函变分的原理或加权余量法构造出与原微分方程相关的离散方程组,最后对离散方程组进行求解即可得到每个节点处的场变量值,以此作为原微分方程的近似解。FEM由于具有通用性强、便于处理复杂的几何形状、求解效率高等优势而被广泛用于结构分析、动力学分析、热学分析等领域,在基于扩散近似的FMT成像中更是成为了主流的正向问题数值解法。
2.2 MC模型及其加速
随机模型是指用统计方法求解RTE的模型。目前提出的随机模型有MC模型[35-37]、随机行走模型[38-39]、马尔可夫(Markov)随机场模型[40]。其中,随机行走模型、马尔可夫随机场模型通过推导光子迁移的概率密度函数来隐式地模拟单个光子的传输,而MC模型则是一种显式模型。随机行走模型可以看成是一种简化的MC模型,它将光子的移动方向限制为三维网格的6个正交方向,在均匀介质中的随机行走模型相当于扩散方程的有限差分法求解;马尔可夫随机场适用于简单组织,难以处理具有复杂拓扑关系的真实组织;相比于前两者,MC模型的普适性高,是目前生物组织光学领域统计的主流方法。在MC模型中,通过对RTE方程的积分形式进行求解,建立了相对应的联合概率抽样函数,从而模拟扩散光子在组织中的传输[41]。目前,可用于层状组织模拟的MC模拟模型[42]和用于复杂解剖结构的基于体素的MC模拟模型都能够精确地模拟光子在组织中的传播[43-44]。MC模型继承了RTE的准确性,又适用于各种复杂边界及复杂异质组织,因此是提高基于扩散光子成像技术精度和定量性能的最佳选择,但是标准荧光MC(sfMC)模型计算效率极低,无法用于FMT成像。
为了将MC方法用于FMT成像,一方面需要发展高效的前向模型MC模拟方法;另一方面需要联合计算机硬件来加速前向模拟和逆向重建。在高效的前向模型方面有微扰荧光MC(pfMC)模型[45]、伴随荧光MC(afMC)模型[46-47]、中路荧光MC(mfMC)模型[48]、解耦荧光MC(dfMC)模型[49-51]等。pfMC模型适用于基于CCD的自由空间探测系统,而afMC模型中的假定源和探测器是可交换的,因此适用于基于光纤式的探测系统,而对于自由空间探测的情形,光源和CCD的复杂特性使得这种对等性很难得到保证。mfMC模型的计算效率显著低于afMC模型和pfMC模型,故很少应用于图像重建。dfMC模型与其他三种荧光MC模型在统计上具有无偏性,故dfMC模型在浑浊介质的任意光学参数下具有更高的计算精度。
图 1. dfMC和pfMC模型模拟的CCD 上荧光强度的分布与实验结果的比较[49]
Fig. 1. Comparisons of fluorescence intensity on CCD detectors among pfMC model, dfMC model, and phantom experiments
在FMT图像重建中,为了得到更好的定位和定量精度,不仅需要模拟大量的光源,还需要保存大量的光子状态和路径信息。这些大量需要模拟的光源及重建中的磁盘读写给计算机带来了极大的运算负担,所以需要联合计算机硬件来构建加速计算环境。总的来看,加速方法主要是使用多计算机、多处理器、多核或者多个流多处理器来并行执行MC模拟。大量光子的跟踪模拟以及不同光子间的模拟各自独立,不存在关联性,这使得MC模型非常适合于进行并行计算。多个并行单元同时运算,可以将MC速度提高2~3个数量级。例如采用多CPU或多核CPU [52-53]、基于CUDA架构的GPU或GPU集群[54-60]、基于集群内多节点并行、CPU内多核并行、GPU内流多处理器并行的CPU-GPU协同加速[61]等策略。GPU比CPU更加适合并行运算,基于GPU加速计算环境的MC运行速度相当于常规CPU运行速度的数百倍。
除上述模型外,还有采用耦合的RTE-DA模型和MC-DA混合模型[62-64],总的思路都是在精度、适用范围、时间和空间复杂度这几个要求之间做平衡和折中。
2.3 提高光学参数建模的准确性
FMT重建的是荧光探针的分布,而组织光学参数,如吸收系数、散射系数等,在建模中作为已知量,
表 2. 用于FMT成像的几种荧光MC模型的比较
Table 2. Comparisons of several fluorescence MC models used in FMT
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因而正向问题计算的精度极大地依赖于组织光学参数的准确性。生物组织具有高度异质性,使用整体的平均光学参数求解正向问题会带来很大误差。目前一些学者提出将不同组织器官的解剖结构作为结构先验信息融入到FMT的正向问题中,对不同组织赋予不同的平均光学参数,这可在一定程度上提高光学参数异质性建模的准确性[65-69],这种结构先验信息通常来自于解剖成像技术(例如电子计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI))或小鼠图谱。由于生物组织微环境的复杂多样性和测量技术的限制,不同组织的光学参数测量值总是存在较大误差,并且通过在文献中查表选取的光学参数不能适应不同实验对象之间的差异性,所以仅通过在正向问题中融入结构先验信息,对于保证后续FMT重建图像的质量是不够的。为了进一步解决这一问题,一些研究者利用扩散光成像(DOT),例如DOT/FMT/CT三模式成像[70]或DOT/FMT双模式成像技术[71],重建出小鼠内部的光学参数分布,然后将重建结果作为功能先验信息引入FMT的重建中。但是DOT的逆向问题也具有高度不适定性,所以重建结果依然容易受到噪声的影响,光学参数重建的不准确性会进一步影响后续FMT的重建结果,并且成像时间、数据处理时间和图像重建时间都会大大延长,不利于观测一些荧光标记物的动态变化。此外,还有学者将归一化玻恩比用于FMT重建,结果虽然证明基于归一化玻恩比的重建结果对吸收系数的高异质性不太敏感,但是重建结果对散射系数的异质性仍然较为敏感[72-74]。
最近,有采用贝叶斯近似误差(BAE)法来补偿FMT图像重建中因光学参数建模不准确而导致的正向问题求解误差,以提升重建图像的质量[75]。在贝叶斯理论框架下,FMT的逆向问题被视为一个统计推断问题。与传统的逆向问题求解方法不同,统计反演问题的解是感兴趣变量的后验概率分布,基于该后验概率分布可以进行最大后验概率(MAP)点估计。较之于传统的求解方法,贝叶斯框架下的统计反演的优势在于它可以很自然地融入不同的先验信息,同时充分利用了边界探测数据之间的时间相关性,最终提高了参数图重建的质量[76-77]。BAE方法在贝叶斯逆理论框架下将误差视为随机变量,并利用大量样本对该随机变量的参数进行估计,然后把这些参数融入到重建过程中,有效地补偿了误差对重建结果的影响。但是,BAE法应用于补偿FMT光学参数建模误差时,假设待重建的解满足多元正态分布,并且每个分量的边际方差都相等,所以重建时容易产生一个较为平滑的解,重建图像中有过多的伪影。为了进一步解决这一问题,有研究者提出通过动态变化BAE的先验分布参数引入稀疏先验信息的方法能够更好地抑制因光学参数建模不准确而导致的重建图像伪影,从而提高荧光团形状重建的准确性[78]。BAE在应用中最大的问题是在估计误差的参数时需要大量样本,且每个样本都需要参与后续的一次FMT正向问题求解,使采用BAE方法的重建过程非常耗时,计算效率也比较低。此外,在先验分布的优化设置方面都有待进一步研究。BAE法还可以对FMT成像中其他方面的误差进行补偿。例如:在利用有限元求解FMT的正向问题时,剖分的越精细,求解精度越高,但同时也会带来计算效率低下的缺陷;这时可以利用BAE法对粗剖分导致的正向问题求解误差进行补偿,以提升重建图像的质量。实际计算正向问题时可以仅采用粗剖分,这样既可保证计算效率,又不会降低求解的精度。BAE法还可以进一步被用于补偿扩散近似或玻恩近似带来的FMT正向问题建模误差。
3 逆向问题
由于FMT的图像重建问题具有高度的病态性,所以除了提高正向问题的求解精度外,还需要克服逆向问题的病态性,从而提高重建图像的质量。目前最行之有效的克服病态性的方法就是在FMT的逆向问题中使用正则化方法。正则化指的是对最小经验误差函数加约束,把一个病态问题转化为一个良态问题。不同的约束形式可以引入解的不同的先验信息,从而在求解逆向问题过程中对解施加不同的约束。正则化方法克服了逆向问题的病态性,降低了解对于噪声和误差的敏感程度。正则化方法主要分为直接正则化方法和迭代正则化方法两大类。一般来说,直接正则化方法适于中小规模的不适定问题,而迭代正则化方法则适用于大规模的不适定问题。下面对FMT逆向问题求解中主要的正则化方法及相应的优化算法进行介绍。
3.1 直接正则化方法
在FMT成像技术中,采用最多的直接正则化方法是吉洪诺夫(Tikhonov)正则化、
3.1.1 Tikhonov正则化
在早期的FMT逆向问题求解中最为常用的是Tikhonov正则化[79-82]。这种正则化方法在目标函数中加入一个解的范数项,该范数项可以视作一种约束解的大小的先验信息。在此基础上,结合拉普拉斯(Laplace)型矩阵[83],可将CT提供的结构先验信息融入到重建中,以提高图像重建的质量。而基于Tikhonov正则化数据驱动的空间可变正则化,由重建数据本身构建解的先验分布,这样就避免了直接将先验结构施加于解,从而进一步改善FMT的定位精度[84]。Tikhonov正则化的优化问题具有形式简单、易于求解等优点,但是会倾向于产生一个过于平滑的解,丢失了解的高频信息,在FMT的重建图像中表现为伪影过多,不能准确地重建真实荧光团的分布[82]。
在优化算法方面,由于Tikhonov正则化的
3.1.2
近年来,引入稀疏先验信息的正则化技术逐渐成为FMT图像重建算法中的研究热点。引入稀疏先验信息的正则化方法又称为
在优化算法方面,由于包含
近年来研究的重权重
图 2. (a)(e)仿体模型;(b)(f) IRL2重建结果;(c)(g) L1重建结果;(d)(h) IRL1重建结果[100]
Fig. 2. (a)(e) Simulated models; (b)(f) reconstructed results of IRL2 regularization; (c)(g) reconstructed results obtained by common L1 regularization; (d)(h) reconstructed results obtained by IRL1
3.1.3 TV正则化
另外一个重要的正则化就是全变差正则化(Total variation, TV)。TV正则化就是把解的全变差半范数作为正则化项以达到抗噪声的目的。在FMT图像重建中,与Tikhonov正则化法相比,TV正则化法能够更好地在解的稳定性和图像分辨率之间折中平衡,具有良好的保持图像边缘的特性[93,101-103],但这种正则化的劣势在于易在光滑区域产生阶梯效应。
同稀疏正则化一样,TV正则化项也是不可微的,也需要比较复杂的优化算法。如Newton迭代法[101]、增广拉格朗日分裂法[102]、分裂 Bregman法[93]以及基于Rudin-Osher-Fatemi(ROF)模型的优化算法[103]都可用于TV正则化模型的求解。
总之,直接正则化方法被广泛用于克服FMT逆向问题的高度病态性,改善重建图像的质量,提高荧光靶标的定位和定量精度。
3.2 迭代正则化方法
迭代正则化方法在迭代过程起到了“自正则化”效应,迭代过程无须明确正则化参数,迭代次数扮演着正则化参数的作用,因而需要寻找合适的终止准则,使迭代次数与原始数据的误差水平匹配是迭代正则化方法的关键。常用的迭代正则化方法有
表 3. 用于FMT的直接正则化方法及主要的优化算法
Table 3. Direct regularization method and main optimization algorithms used in FMT
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Landweber 迭代法、共轭梯度最小二乘法、代数迭代技术(ART)、 投影重开始共轭梯度标准残差法(prCGNR)等[104-106]。这些迭代算法在本质上都具有正则化的效果,算法的存储量小且稳定,但在噪声水平或建模误差较大时,上述算法的重建质量不佳。
3.3 混合正则化方法
混合正则化方法是将不同的正则化方法结合起来使用的方法,可将多种先验信息结合起来共同约束解的性质。如将
4 总结和展望
由于无法直接“看见”生物组织内部标记的荧光团,FMT需要利用不同角度的激发光和荧光的投影数据,并借助一定的图像重建方法重建出组织内部目标荧光团的分布,因此FMT最终的成像质量极大地依赖于图像重建方法的优劣。提高FMT正向问题的精度以及有效地改善FMT逆向问题的病态性是图像重建中涉及到的两个关键问题。在FMT正向问题中应根据实际成像的生物组织光学特性选择恰当的正向模型和相应的数值求解方法,同时根据生物组织异质性的程度对光学参数建模误差进行补偿。在逆向问题求解中应考虑通过不同的正则化方法有效地融入不同的先验信息来改善逆向问题的病态性,并根据不同的正则化方法采用相应的优化算法,以最终实现目标荧光团的准确重建。
FMT成像技术在图像重建方面取得了很大进展,但是由于图像重建方法种类繁多,目前FMT图像重建软件系统的标准化与规范化还有待进一步建设和规划。此外,值得进一步关注的是复杂生物系统中靶向的荧光分子具有时间、空间和功能上的多尺度性,单一的光学成像模式无法实现其多尺度特征的连续成像观测。目前,介观光学成像技术的提出可填补微观光学成像技术和宏观光学成像技术的间隙[109-110]。在未来,介观FMT和宏观FMT有望结合在一起形成多尺度的光学成像模式,从而实现两者成像的优势互补。其中宏观光学成像模式主要应用于大视场、低分辨、深层组织的成像,介观光学成像模式主要用于小视场、高分辨、浅层组织的成像。在多尺度光学成像模式中,一个关键的难点是如何准确获取复杂异质生物组织中靶向荧光分子的多尺度、多分辨率的三维图像重建结果。MC模型由于适用于具有任意光学参数的生物组织,且计算精度高,对光源和探测器间距没有限制,是介观FMT和宏观FMT成像模型的首选,然而荧光 MC 模型的低计算效率仍制约着其在高精度成像中的应用。因此,未来迫切需要研究高效率的荧光MC模拟方法,以同时满足介观FMT和宏观FMT的成像需求。
相对于传统的单一尺度的介观或宏观光学成像模式,多尺度光学成像模式可以提供更加丰富的信息,应用前景非常广阔:在肿瘤方面,可应用于探测和监控癌症的发生、发展,促进抗癌药物的研发;在神经科学领域,可以为神经退行性疾病、脑血管疾病、脑肿瘤、脑代谢疾病等领域提供新的检测方法;在细胞示踪方面,通过标记特定的细胞群可以无创地检测它们的转移、增殖和结局。
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