超分辨光学显微成像的新武器——镧系离子掺杂上转换纳米荧光探针(特邀)特邀综述
1 引言
荧光超分辨显微成像让观察纳米尺度的荧光体结构变化与动态追踪成为了可能。这些荧光体不仅包括生物样品更包括了纳米颗粒,甚至玻色子例如激子。在过去的20年间,多种超分辨技术已被开发和实现,其中包含受激发射损耗荧光显微镜(stimulated emission depletion)、随机光学重建显微镜(stochastic optical reconstruction microscopy)、结构光照明显微镜(structured illumination microscopy)、光学波动成像显微镜(super-resolution optical fluctuation imaging)等技术。这些技术基本以“更清晰、更快、成像深度更深、观察更久、通量更大”为目标。但是每一种技术都有它的局限性,并不能达到所有需要的目标,这在一定程度上制约了超分辨成像技术的发展和在诸多领域的应用。在开发成像技术的同时,开发超分辨成像的探针也是一个非常重要的方向,因为一种超分辨技术的开发往往是围绕纳米探针的独特性质实现的。特殊的超分辨荧光探针不仅可以利用光开关和光调制来增强成像分辨率、利用工作波长来实现更深的穿透深度,同时它还可以提供更强大的新能力。这种新能力不仅可以提供复用成像的新维度,实现不需要激发光源的化学结合成像,还可以实现温度成像、应力成像与空间成像相结合的多模态成像,这为生物研究提供了独一无二的工具。如果说不同的超分辨成像技术就是不同的“武功心法”的话,那么荧光探针就是“神兵利刃”,能够辅助其到达成像的巅峰。本文将介绍一柄超分辨成像的“绝世好剑”——上转换纳米颗粒。
2 上转换纳米颗粒
作为一种反斯托克斯发射的非线性光学现象,光子上转换是指吸收两个或多个低能光子继而发射出一个高能光子的现象。这一概念最初是由荷兰裔美国物理学家尼古拉斯·布隆伯格于1959年提出的一种理论可能性[1]。
随着激光器及其相关光纤技术的出现,从20世纪60年代中期开始,几个研究小组开始探索利用无机固体得到上转换光学信号。Auzel[2]于1966年最先描述了“上转换”的概念,总结了其机理并报道了利用Yb3+敏化Er3+和Tm3+离子的基于能量上转换的可见光发射机制。Ovsyankin和Feofilov[3]在同一年也独立观察到了这种Yb3+敏化的上转换。不久之后,人们利用Yb3+-Ho3+耦合实现了上转换原理发射绿光[4-5]。自那以后,光子上转换领域不断优化设计,产生了适用于许多领域的不同波长的可见光[6]。
光子上转换过程为非线性光学技术提供了一种可以将低能量光子吸收转换为高能持久的可见光发射的简便方法,但需要一些必要条件,如较长的激发态寿命和能级的相似间距阶梯状排列。因为光学跃迁是局域化的,上转换发射很少受到环境的影响,通常不受量子限制的干扰,有利于镧系离子激发态的顺序激发和离子-离子相互作用。上转换发光的强度一般与激发光的密度呈非线性关系[7]
式中:
据报道,掺杂适当过渡金属离子的载体可以进行上转换发射。在量子点和有机染料的双光子吸收、二次谐波产生和反斯托克斯拉曼散射中也实现了上转换过程[8-9]。然而,这些系统需要具有挑战性的条件,如极低温、高功率密度或昂贵的超短脉冲激光器。
相比之下,使用镧系元素掺杂固体材料可以实现更高的上转换效率。镧系离子是适用于光子上转换过程的元素,因为它们的4f价电子的能级间隔表现出阶梯状的结构,恰好对应于近红外和可见光光子能量发射状态,两个或多个近红外泵浦光子被镧系离子的中间能级吸收再发射的非线性过程就会使得光的发射波长短于入射波长。这正是在20世纪60年代中期由Auzel、Ovsyankin和Feofilov在块状晶体中构想研制的[10]。此后,人们对镧系掺杂上转换发光进行了大量的研究,发现并应用了其优异光学性能,包括显著的反斯托克斯位移、优异的光稳定性、清晰可调的多峰线发射、长而可调的发射寿命以及高抗光学闪烁和光漂白的性能[11]。这些特性使得镧系掺杂上转换材料成为从生物测定和光催化到超分辨成像和三维成像等各种应用的理想候选者,
直到20世纪90年代末,纳米科学技术在材料科学领域取得了长足的进步,上转换纳米材料得以推广。研究者们通过不同的化学工艺,设计并合成了具有可控成分、晶相、尺寸和形状的高质量上转换纳米颗粒(UCNPs)[12]。纳米材料中的上转换能量转移过程与块状材料相似,不过由于纳米颗粒中存在的尺寸限制,离子-离子和离子-晶格之间的相互作用在不同程度上被改变,可以精确地调谐从紫外到近红外区域的特定波长。这些UCNPs的出现极大地发掘了非线性光学在先进纳米光子学和生物研究中的应用潜力。由于体积小、毒性低、生物相容性好、光稳定性高等突出特点,UCNPs作为生物成像领域的发光探针尤其具有吸引力。经过几十年的发展,涉及镧系离子的光子上转换过程目前主要分为五类:激发态吸收上转换(ESA)、能量传递上转换(ETU)、光子雪崩(PA)、协同能量转移(CET)和能量迁移介导的上转换(EMU)[13-14]。所有这些过程都涉及两个或多个光子的连续吸收和高能光子发射[15],如
图 1. 镧系元素掺杂纳米材料的主要上转换机制。(a)激发态吸收上转换;(b)能量传递上转换;(c)光子雪崩;(d)协同能量转移上转换;(e)能量迁移介导的上转换(图中红色箭头表示直接激发过程,蓝色箭头表示辐射发射过程,虚线箭头表示能量传递过程,A是活化剂离子,S是敏化剂离子,M是能量迁移离子,L是阶梯能级离子)
Fig. 1. Principal upconversion mechanisms of lanthanide-doped nanomaterials. (a) Excited-state absorption; (b) energy-transfer upconversion; (c) photon avalanche; (d) cooperative energy transfer; (e) energy migration-mediated upconversion (red arrows stand for direct excitation processes, blue arrows represent radiative emission processes, dashed arrows represent energy transfer processes, A means activator ion, S means sensitizer ion, M means migratory ion, and L means ladder ion)
在激发态吸收上转换(excited-state absorption)过程中,稀土离子可以吸收连续的低能量泵浦光子,从基态能级跃迁至中间亚稳态能级,然后到达更高的激发态能级,最终释放出一个高能光子。这个过程有严格的限制,包括激发态离子必须具有足够大的吸收截面以吸收第二个泵浦光子,并且通常仅在单一稀土离子(如Er3+/Nd3+/Tm3+等)掺杂的体系中发生。然而,连续吸收第二个光子时的效率较低,体系中可能存在其他上转换过程,如能量传递上转换、光子雪崩、交叉弛豫等。
能量传递上转换(energy transfer upconversion)通过涉及两种稀土离子:敏化剂和活化剂,实现了目前使用较为广泛、发光效率较高的一种上转换机制[16]。在泵浦光源下,敏化剂离子吸收光子跃迁到激发态,然后将能量传递给附近的活化剂离子,活化剂离子获得多个光子的能量后发射高能光子。通常,敏化剂离子的能级需与活化剂离子匹配且吸收截面大于活化剂离子的吸收截面。通常使用吸收截面较大的Yb3+离子作为敏化剂与活化剂离子共掺杂,如NaYF4材料中的 Yb3+/Er3+、Yb3+/Ho3+、Yb3+/Tm3+等体系[17-18]。能量传递上转换还需敏化剂离子与活化剂离子距离较近,例如:Er3+离子单掺杂体系中,掺杂浓度较低时主要通过激发态吸收上转换发光,增加掺杂浓度后能量传递上转换占据主导,发光效率有所提高。
光子雪崩(photon avalanche)是一种特殊形式的上转换过程,2017年才在上转换纳米颗粒体系中被发现。其亚稳态能级和基态能级之间的能量差和泵浦光源不匹配,但当得到超过特定阈值的激励功率时,可以利用特殊的能量循环路径在几乎不进行基态吸收的情况下发射出强上转换荧光。具体过程如下:通过非谐振弱激发态吸收将电子填充到中间亚稳态能级上,而后电子通过谐振激发态吸收跃迁至高能级上,接着重复通过高能激发态离子与邻近的基态离子之间有效的交叉弛豫能量转移过程,使中间亚稳态能级上的粒子布居数呈指数式增加。当中间态离子的消耗小于基态离子的消耗时就产生了强上转换发射,形成雪崩过程。因此光子雪崩的明显特征就是:发射强度和泵浦激光功率具有强依赖关系。继首次在Pr3+掺杂的红外量子计数器中发现了PA过程之后[19],研究者在Pr3+/Tm3+/Nd3+等掺杂体系中都观察到了这种光子雪崩现象[20]。近年来,除用于小型激光器外,PA机制还用于实现超分辨率成像[21]。
协同能量转移(CET)过程中,离子的相互作用至关重要,敏化剂和活化剂不可或缺。两个能量供体通过吸收光子协同激发到虚激发态,同时将能量传递给相邻受体,从而发射一个高能光子。上转换包括协同敏化(如Yb3+-Tb3+、Yb3+-Eu3+和Yb3+-Pr3+离子对)[22-23]和协同发光(如Yb3+-Yb3+离子对[24])。然而,由于激活剂缺乏长寿命的中间态能级,纳米材料中的上转换效率相对较低。尽管大多数研究集中在块状材料上,但仍有研究表明,纳米材料中协同能量转移上转换是可行的[25]。
能量迁移上转换(energy migration-mediated upconversion)是Wang等[26]于2011年提出的一种利用纳米核壳结构实现的上转换发光过程。该过程涉及四种离子分布在不同的壳层中:敏化剂离子、能量累积离子(或称阶梯能级离子)、能量迁移离子和活化剂离子。在受到低能量光子激发时,ETU过程首先发生,将能量累积离子不断激发至较高能级。然后,能量迁移离子从邻近的能量累积离子中提取激发态能量,并将其传递到相邻的壳层区域。最终,活化剂离子捕获能量并再次回到基态,释放较强的上转换发光。这个过程同时也会导致部分能量累积离子发生上转换发射。这种新型的能量传递机制可以用于多色发光调控和寿命调节等。在Auzel等的研究中发现,ETU过程的量子效率比ESA和CET过程高出两三个数量级,ETU是多掺杂上转换系统中的一个常见过程。随着核壳合成技术的发展,EMU作为ETU的延伸出现,拥有特殊能级的镧系离子被引入单独的层中。核壳纳米颗粒中的光子上转换为调节掺杂剂之间的相互作用开启了新的研究方向。此外,核壳纳米颗粒中不相容的掺杂剂离子可以被限制在单独的层中以消除短程交叉弛豫带来的猝灭效应,也能进一步利用长程能量迁移过程来控制光子动力学路线[27]。
3 超分辨荧光显微镜
基于实验证据和物理学原理,阿贝提出了一个著名的重要结论,即显微系统的分辨率不能绕过衍射极限。具体来说,就是由于光学衍射,光学分辨率一般不能小于半波长(使用空气显微镜头的时候),所以小于200 nm的结构特征一般无法用传统光学显微镜分辨。
式中:
面对
自20世纪90年代以来,现代研究技术方法不断进步,跨学科交叉研究蓬勃发展,给成像领域带来了长足的进步,如更安全的标记,更深入的观察,以及更高的空间和时间分辨率。2014年,超分辨荧光显微镜的发展获得了诺贝尔化学奖,成像模式被认为是必不可少的突破性发明。不同的超分辨显微技术的潜在能力尚未被完全探索,应用的最佳途径仍然不确定。这促使我们探索设计更好的光学远场方法,以便呈现亚显微细胞结构和蛋白质在活细胞内的分布。随着纳米级别的高分辨率成像为各种生物系统的研究提供了新的切入点,超分辨成像领域方兴未艾[28]。
超分辨荧光显微技术的发展始于20世纪90年代初,从成像基本原理出发可大致分为两类。第一类超分辨技术主要基于激发光的点扩散函数或者光学传递函数调制,有受激辐射淬灭(STED)显微镜、基态损耗(GSD)显微镜和结构光照明显微镜(SIM)等。第二类是依赖于单分子的随机闪烁性,利用算法进行空间定位,包括光致激光定位显微镜(PALM)和随机光学重建显微镜(STORM)。在这些方案的基础上产生了许多发展组合以及先进的成像处理算法[29],结合起来提高了现有成像方式的性能。基于UCNPs较好的发光稳定性、非线性响应以及多能级调控能力,UCNP与点扩散函数调制和结构光照明等方法结合得比较多,这些成像方法的原理如
图 2. 超分辨显微镜的原理。(a)受激辐射淬灭显微镜[50];(b)荧光发射差显微镜[50];(c)超线性激发发射显微镜[54];(d)结构光照明显微镜[54]
Fig. 2. Principle of super-resolution microscopes. (a) Stimulated emission depletion microscope[50]; (b) fluorescence emission difference microscope[50]; (c) super-linear excitation-emission microscope[54]; (d) structure illumination microscopy[54]
受激辐射淬灭显微镜(STED)[
STED光束激发荧光状态的非线性耗竭是实现超分辨率的基础,特点是强度在焦点中心接近零,向外围呈指数增长。[19]一旦STED光束的功率超过设定的阈值,大多数自发荧光就会被耗尽。随着功率的进一步增强,非荧光区域不断扩大,但对中心区域的荧光影响不大。当两个激光脉冲叠加时,只有位于STED光束中心的探针才能产生荧光发射,这极大地缩小了有效PSF的尺寸。剩余有效PSF的FWHM可以近似表示为
式中:
荧光发射差(FED)显微镜[32][
式中:
简单地说,发射光由高数值孔径的物镜收集,并由透镜聚焦到单光子探测器上,因此有效
式中:
虽然FED显微镜提高了分辨率,但基于常数归一化系数
超线性激发发射显微镜(SEE)[
式中:
结构光照明显微镜(SIM)[
有机荧光染料和蛋白质是SIM最常用的成像探针,因为它们具有特异性染色靶向细胞器的出色能力[38]。然而,这些吸收截面较小的探针需要高功率脉冲激光来激活多光子吸收过程,限制了活细胞中亚细胞结构的长时间可视化[39]。
4 基于上转换纳米颗粒的超分辨荧光显微镜
在超分辨率成像中,发光探针是以纳米精度标记和揭示目标分子结构和活性的关键工具。理想的探针应该具有足够的亮度、优异的光稳定性、良好的生物相容性等[40]。有机染料和荧光蛋白标记法具有体积小、生物相容性好等优点,是目前上述远场超分辨显微镜中广泛应用的成像探针。但是传统的发光探针在高能紫外线或高能可见光的激发下只能发射能量较低的光子,造成生物分子的光损伤和自荧光,导致采集到的成像数据信噪比较低。因此,超分辨揭示细胞内图景的目标要求寻找新的具有高亮度和抗光漂白的替代探针来推进显微领域发展。
纳米颗粒虽然比染料分子和蛋白质大,但是由于其卓越的光物理性质,已成为生物标记和生物传感、药物递送、癌症治疗、长期分子跟踪、太阳能电池应用和触发化学反应等多个领域研究的优秀候选项[41-43]。近年来,许多超分辨率模式都采用纳米颗粒作为荧光纳米探针,包括量子点(QDots)、碳点(CDots)、聚合物点(PDots)、聚集诱导发射(AIE)点等。各种纳米颗粒在生物研究的超分辨率成像中显示出巨大的优势,但在深层生物组织中进行长期跟踪和超分辨率成像的分析却很少。主要原因是这些纳米粒子的激发和发射光位于可见光和紫外波长范围内,在深层组织中的穿透能力较低,且其中一些含有对生物样品有害的重金属[44]。此外,与染料和蛋白质相比,这些荧光纳米颗粒具有相对的光稳定性,但在长时间观察中,如何抵抗光漂白仍然是一个重大挑战。
为了解决上述问题,可将UCNPs作为一种具有小体积高密度发射的新型多光子探针。每个UCNP包含数千个共掺杂镧系离子,形成光子敏化剂和激活剂网络,具有将近红外(NIR)转换为短波长的近红外、可见光和紫外线发射的独特非线性光学特性。此外,通过适当的表面修饰。UCNPs可以通过内吞作用被细胞很好地内化,且对细胞增殖和生存能力没有明显的毒性作用。UCNPs由于具有显著的抗Stokes光谱偏移、无背景、光稳定、低毒性和高成像穿透能力等优越的物理化学特性而在超分辨领域引起了人们的广泛关注。下面我们列举了几类典型的上转换超分辨成像技术。
1)UCNP-STED显微镜。最近的研究表明,每个纳米粒子具有数千个发射点的UCNPs可以作为合适的单分子探针,从而在生物等超分辨率成像中实现明亮的发射。研究者提出了UCNP辅助STED纳米显微镜(UCNP-STED)的概念,并证明了在1 mW功率的980 nm激光和40 mW固定的808 nm激光的激励下,在解析单个13 nm UCNP簇时实现了低于30 nm的光学分辨率[
图 3. UCNP在各种超分辨技术中的应用。(a)低功率STED显微镜超分辨[21];(b)用抗体偶联的UCNP对细胞骨架蛋白结蛋白进行免疫荧光标记的STED超分辨率成像[45];(c)非漂白FED显微镜[48];(d)傅里叶异色融合FED[50];(e)近红外发射饱和显微镜深层组织成像[49];(f)用于三维亚衍射成像的超线性激发发射常规共聚焦成像[52];(g)神经元表型细胞内吞的UCNP超分辨率uSEE-STED成像[53];(h)非线性SIM显微超分辨[56]
Fig. 3. Applications of UCNP in various super-resolution microscopy. (a) Super-resolution of low-power STED microscopy[21]; (b) immunofluorescence labeling of cellular cytoskeleton protein desmin with antibody-conjugated UCNPs and super-resolution imaging[45]; (c) non-bleached FED microscopy[48]; (d) Fourier-domain heterochromatic fusion[50]; (e) deep tissue imaging by near-infrared emission saturation microscopy[49]; (f) super-linear excitation-emission conventional confocal for three-dimensional subdiffraction imaging[52]; (g) super-resolution uSEE-STED imaging of UCNPs endocytosed by a neuron phenotype cell[53]; (h) nonlinear SIM microscopy super-resolution[56]
STED超分辨的实现受限于高功率,而UCNP-STED正具有降低所需功率的优点,能产生多甜甜圈光束从而实现快速并行化纳米显微镜[46]。在较低功率下用耗尽光束传导UCNP-STED,几乎不产生任何自身荧光,从而可以获得优越的信本比,目前对单个UCNP进行成像能达到分辨率为28 nm,即波长的1/36。镧系元素纳米探针有望扩展STED显微镜的应用领域,为在空间和时间维度上对细胞过程进行高分辨率延时研究铺平道路[47]。
虽然UCNP辅助STED比传统染料STED降低了两个数量级的功率,但仍然存在一些限制。首先,耗尽光束依然需要比激发激光高得多的功率。其次,该STED方案要求熟练的双激光束对准技术,这限制了该技术的非专业实验室和应用。最后,耗尽光束匹配UCNPs中能级的目标带隙的特定要求限制了其在各种发射波长中的优势。因此,在超分辨显微镜中利用UCNPs代替受激发射是一种便捷有效、潜力巨大的方法。
2)UCNP-FED显微镜。传统FED显微镜使用荧光染料和蛋白,容易受光漂白影响,不适合长时间成像。抗漂白的UCNP-FED显微镜引入Nd3+/Yb3+/Er3+共掺杂UCNPs,以800 nm 10 MW·cm-2激发,实现了172 nm的分辨率。
出于简化耦合系统难度、降低系统复杂度的考虑,研究者进行了探索多色非线性响应和傅里叶域融合以提高空间分辨率的研究[50]。与需要使用双激励程序切换照明模式相比,单扫描方法简单、快速且稳定,可以避免在校正多个样本漂移时使用额外的光学组件和程序,而且使用简化的光学设置与标准商用或实验室激光扫描显微镜兼容。
这些工作进一步表明,UCNPs的材料设计可以改善其光学特性以提高分辨率,这为材料科学界研究提供了一个新的主题,特别是通过深层组织进行更有效的超分辨率探针。此外结合自愈贝塞尔光束,研究人员探索了用这种亚衍射成像方式绘制强散射肿瘤细胞球体内的单个纳米颗粒的可行性[51]。
3)UCNP-SEE显微镜。一种名为超线性激发发射显微镜的方法为在传统共聚焦配置上实现生物样品的三维亚衍射成像提供了实验证据[
4)UCNP-SIM显微镜。普通SIM的分辨率只能够提升一倍[55],想要提升更多分辨率就需要引入非线性过程增加图像中的高阶空间频率的部分。通常这一过程需要利用高激发功率的饱和现象来实现。基于UCNP的高非线性效应与近红外激发与荧光,非线性上转换SIM应运而生,它提出了一种利用UCNPs通过厚生物组织创建视频速率超分辨率成像的策略。UCNPs独特的非线性光响应使得SIM上的有效非线性模式可以在成像平面的傅里叶域中获得高频谐波,实验表明微调UCNPs中的掺杂浓度可以改变光子响应的非线性,进一步将分辨率提高到激发波长的1/7[56][
值得一提的是,基于UCNP的超分辨显微镜除了有上述提到的优势以外,还可以实现跨维度的多路复用超分辨成像。“多路复用”是指沿单个通信通道同时传输多个消息。多路复用技术在生物、医学、防伪和显微成像等复杂领域具有重要意义。传统超分辨显微镜的多路复用受限于荧光探针的能力,其维度仅限于荧光颜色和发光极化种类,并且通道数目有限。而UCNP基于不同掺杂离子与对其复杂的非线性能量传输进行的调控,可以进一步添加更多的超分辨复用维度[58]。例如:利用高掺杂浓度颗粒与低掺杂浓度颗粒在同样照射光强的区别,可以进行单颜色通道光强维度的复用成像[59];利用能量传输调制的寿命谱线的不同,可以进行荧光寿命复用超分辨成像[
图 4. UCNP在多路复用超分辨技术中的应用。(a)超分辨率模式下多通道单τ2点的深度学习辅助解码[57];(b)混合UCNP的超分辨复用[58];(c)使用三种不同上升-衰减指纹的Nd-Yb-Tm系列τ2点安全油墨进行时域防伪;(d)使用五种类型的Nd-Yb-Er系列τ2点探针进行多重单分子数字测定,以量化五种靶病原体单链DNA[13]
Fig. 4. Applications of UCNP in Multiplexed super-resolution microscopy. (a) Deep learning assisted decoding of multi-channel single τ2-dots in super-resolution mode[57]; (b) super-resolved multiplexing of mixed UCNPs[58]; (c) time-domain anticounterfeiting by using three types of Nd-Yb-Tm series τ2-dots security inks with different rising-decay fingerprints; (d) multiplexed single molecule digital assays using five types of Nd-Yb-Er series τ2-dots probes to quantify the five kinds of target pathogen single-stranded DNAs[13]
5 结束语
本文总结了UCNPs在提高超分辨率显微镜性能方面的应用。UCNPs的非线性光子响应在降低激光功率、提高探针光学稳定性、增加成像深度、加快成像速度、提升整体质量等方面带来了一些具体进展。
通过诱导光子雪崩效应,UCNP辅助的STED显微镜提供的饱和强度比目前在常规受激发射耗尽显微镜中使用的荧光探针低两个数量级,这提供了一种缓解平方根定律的新思路。UCNP在连续激光照射30 min后仍保持稳定,使得抗漂白FED显微镜克服了强耗尽激光的需求且不受试剂种类的限制;uSEE-STED模式结合验证了UCNPs在固定的神经元细胞中可以在三维亚衍射成像条件下连续可视化超过5 h。在没有任何像差校正的情况下,结合UCNP的近红外发射饱和显微镜在深度达93 μm的组织中保持了低于50 nm的相对一致的分辨率。基于时间-波长-空间转换,多光子上转换时间编码结构光照明显微镜在利用UCNP保持低激发功率的同时,以50 MHz的调制和扫描速率跨越了图像采集的速度限制。对单个UCNP进行成像时最小分辨率达到28 nm,即波长的1/36;采用UCNP 的超分辨结果在较理想条件下轴向和横向的分辨率较先前得到了双倍的提高;通过如傅里叶域异色融合等PSF工程技术,利用单个UCNPs的异色光学非线性响应曲线,显著提高图像质量。
尽管UCNP在超分辨成像方面的应用潜力是巨大的,但是它的发展局限也同样显著,使用UCNP进行超分辨率成像正面临巨大挑战。一方面,由于镧系元素的4f构型内跃迁被5s25p6壳层屏蔽,UCNP的能级位置和激发、发射波长几乎是不变的[45],所以UCNP相较于有机染料和量子点不够灵活,如何拓展UCNP的吸收和发射能力,是该方法发展的关键之一。例如使用染料的三线态与UCNP的能级进行互动来扩大吸收光谱范围与效率就是热门发展方向之一[60]。另一方面,受相对较大的颗粒尺寸和复杂的表面化学的限制,UCNP通常需要抗原/抗体作为媒介进行内吞作用来实现摄取和细胞内递送,导致与荧光蛋白相比标记的特异性较低[15]。
为了克服基于UCNP的超分辨率显微镜方法的局限性,进一步开发其在生物成像领域的潜力,对纳米颗粒进行深入研究迫在眉睫。首要目标是设计更小、更亮的UCNPs。理想的荧光纳米颗粒应当在生物应用中干扰最小,尺寸更小的UCNPs对标记靶标的空间功能影响更小,不仅可以穿越细胞器膜,而且具有更好的靶向特异性。然而,亮度和尺寸之间存在不可避免的权衡[61]。UCNPs的亮度与所含掺杂离子的数量成比例地减少并且较小的尺寸会导致表面淬火增强和亮度降低[62]。为了解决这些问题,迭代动力学建模、优化晶体主体和掺杂剂浓度,以及薄壳包裹纳米晶体等方法被相继提出[63],成功地生成了亚10 nm范围内的UCNPs,并保持了其光学稳定性、高均匀性、亮度和单分散性。
其次是优化UCNP的表面修饰。UCNPs的表面改性对其在生理环境中的稳定性和标记亚细胞结构的特异性至关重要[64-65]。目前,采用硅烷化、配体相互作用和配体交换反应等方法对UCNPs进行二氧化硅包覆,是制备稳定分散体并可进一步功能化的常见手段。表面修饰阶段需要将疏水表面配体替换为亲水性配体,以实现亲水性表面组合物。表面功能化的UCNPs通常需要与更多负电荷的配体分子结合,以增强其在生理环境中的稳定性。尽管在将UCNPs特异性标记到亚细胞结构上仍存在一些挑战,但近年来已取得了一些进展,包括生物偶联、细胞光遗传学和细胞内长期跟踪等应用,为更好性能的新策略和方法的研究铺平了道路。
除此以外,进一步开发UCNP的光响应能力也是发展的关键之一。例如,在2022年Schuck教授课题组[66]发现了使用高功率1064 nm激光可以调制UCNP的光子效果,进而实现发光暗态,首次用UCNP实现了单分子定位成像(SMLM),分辨率高达亚埃米等级。
综上所述,镧系上转换纳米颗粒在超分辨率成像领域展现出巨大潜力。本文系统地探讨了UCNP结合超分辨成像的原理、应用和最新进展,强调了其在光学和生物学等领域的重要性。尽管取得了显著的成果,但仍然存在一些挑战,如颗粒形态、细胞标记、功率依赖等方面的瓶颈[67]。未来的研究方向包括操纵上转换发射以实现更广泛的生物应用、合成具有明亮发射的较小UCNP以及集成多种成像模式等。克服这些挑战将促进更好地利用镧系上转换纳米颗粒在超分辨率成像中的优势,为生命科学研究以及微纳结构成像提供更为精准和深入的视角。
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