1 引言

外伤性脑损伤(TBI)是一种常见的公共健康疾病,由于其并发症所导致的思维、感觉、语言以及情绪上的影响与变化并不明显,因此常被称为“沉默的流行病”。根据美国政府的一份研究报告,在美国,每年有约170万人遭受TBI,其中死亡人数约为5.2万人,占所有与伤害相关死亡人数的30.5%^[1]。在发展中国家以及工业化国家中,随着交通以及建筑工业的迅猛发展,TBI已成为导致疾病和残疾的最主要因素^[2]。TBI发生后,脑创伤通常伴有不同程度的脑水肿^[3]。在创伤组织内部及周围,脑内血流低于缺血阈值,这会导致“弥漫性半影”的缺血状态^[4]。创伤和缺血共同构成了TBI的病理学过程^[5]。在脑外伤手术中,脑功能区的定位以及坏死脑组织的辨认具有极大难度,会导致手术过程中额外的清创、致命的并发症和永久性的脑功能损伤。因此,精准的TBI神经外科手术在临床上具有重要意义。在外科手术中,除了医生的经验外,传统的医学成像技术,如计算机辅助层析和磁共振成像能够提供有用的信息。然而,这些技术需要使用全身成像,具有成本高、系统复杂、采集时间长等诸多缺陷。当前,迫切需要一种更有效的技术手段,来帮助医生在TBI发生后更好地进行创伤程度的评估以及手术的执行。

太赫兹波位于红外与微波波段之间,具有非电离性和无损性等优良特性。近年来,太赫兹波成像作为一种生物组织高灵敏度检测技术,被人们广泛研究^[6-9]。太赫兹波成像技术在皮肤癌^[10]、乳腺癌^[11]、脑胶质瘤^[12]以及口腔癌等^[13]的检测应用方面已取得了巨大发展。鉴于脑创伤组织周围水肿区域较为明显,而太赫兹波对生物组织中细胞密度、水分分布和含水量较为敏感,因此可以尝试采用太赫兹波成像检测TBI的分布特征。

本文采用Feeney's自由落体击打方法制备颅脑创伤的大鼠动物模型,利用太赫兹波透射式成像系统对正常鼠脑和创伤鼠脑的组织切片分别进行成像,分析两者太赫兹波透过率的差异;之后进一步对不同深度的切片进行成像,并结合三维重构技术,实现了鼠脑内部创伤区域的三维空间分布检测。该结果表明,基于太赫兹波多深度切片成像的三维重构技术在疾病组织的空间分布检测方面具有一定的应用潜力。

2 实验方法

2.1 自由落体击打性颅脑创伤动物模型制备

实验选用购于第三军医大学动物中心的成年雄性Sprague-Dawley大鼠,它们的质量在250~280 g之间。采用Feeney's方法建立自由落体击打性颅脑创伤动物模型^[14]。首先使用戊巴比妥(质量分数为50×10^-6)进行腹腔注射麻醉,并将大鼠头部固定在立体定位仪上。刮去毛皮后进行常规消毒,沿中线切开头皮,采用牙钻进行右颅骨开颅术。开颅直径为4.5 mm,开颅区域位于前囟门后侧3 mm,侧边2.5 mm处,开颅手术中避免硬脑膜撕裂伤。一个质量为30 g、半径为4.5 mm、长度为5 mm的砝码从大鼠头颅上方25 cm处自由落体,撞击裸露的硬脑膜,以此来制作颅脑创伤模型。为了能够精确撞击硬脑膜,砝码每次都从颅脑上方的空心金属管内落下,金属管上每隔1 cm开一个孔,用于减小空气阻力,实验装置如图1所示。此外,实验中设置了对照组作为对比,对无创伤的正常大鼠也进行了相同的开颅手术操作。模型制备完成24 h后,分别采用TTC染色和神经功能损伤评估对模型进行病理学验证,用以证明模型的成功制备。本文所有动物实验的操作均依照中国动物福利法的规定进行,并且得到了陆军军医大学实验动物伦理委员会的许可。

图 1. TBI动物模型实验装置

Fig. 1. Experimental setup of TBI animal model

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2.2 太赫兹波成像系统

图2为太赫兹波透射式成像系统示意图。实验中采用一个光泵太赫兹气体激光器(FIRL100型,Edinburgh Instruments公司,英国)作为太赫兹辐射源,它可以产生高功率、频率可调谐的连续太赫兹波,且具有光束质量高、稳定性好的优点。激光器工作在2.52 THz,其输出功率可以达到150 mW。实验选用可在室温下工作的高莱探测器(GC-1P型,Tydex公司,俄罗斯)探测太赫兹波的强度。考虑到高莱探测器的响应特性,采用一个斩波器将连续太赫兹波调制成正弦脉冲信号,斩波频率为50 Hz。为了减小太赫兹源不稳定性带来的图像噪声,采用一个太赫兹分束器将太赫兹波分为两束,一束光作为信号光用于成像,另一束光作为参考光用于监测太赫兹辐射源的功率波动,以提高信噪比。信号光经镀金平面镜反射后,由焦距为30 mm的球面透镜聚焦,然后垂直入射样品。样品固定在一个电控x-y位移平台(SGSP20-85型,Sigma Koki株式会社,日本)上,确保样品在焦平面上实现逐点扫描,扫描速率约为10 pixel/s。透过样品的太赫兹波经过另一个球面透镜,并通过一个镀金离轴抛面镜会聚到高莱探测器内。采用刀口法测量可得到成像系统在x轴上的分辨率为260 μm,由于太赫兹辐射源的光斑为椭圆形光斑,其在y轴上的分辨率稍差,约为380 μm。在成像实验中,扫描步长设定为250 μm。

图 2. 太赫兹波透射式成像系统示意图

Fig. 2. Schematic of terahertz transmission imaging setup

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2.3 成像样品的制备

鼠脑组织于创伤24 h后取出,并放入冰冻切片机(CM1950,Leica公司,德国)中进行切片。如图3(a)所示,从颅顶位置开始,沿着箭头方向不断地向创伤位置制备切片,从而获取不同深度的组织切片。图中黑色线段表示切片的方向,其中每相邻两个切片的纵向距离约为320 μm。为了提高太赫兹波成像的对比度并保持较高的信噪比,鼠脑切片的厚度设为40 μm,每个鼠脑组织共获得13个组织切片。将切片夹在两片厚度为0.8 mm的石英片基底上,并在两块石英片中间涂抹油酸包裹切片,这样可以有效防止组织切片在实验过程中的水分蒸发。油酸在太赫兹波段具有较高的透过率,因此不会对成像结果造成影响^[15-16]。图3(b)为制备完成的成像样品。

3 实验结果及分析

鼠脑样品共计24例,其中6例为正常鼠脑,18例为创伤鼠脑。采用苏木素-伊红(HE)染色法分别处理正常和创伤的鼠脑组织,它们的显微图像如图4所示:正常鼠脑的神经细胞结构完整紧密,创伤鼠脑的细胞结构松散,细胞密度降低,并存在细胞质空泡化现象。

图 3. 实验照片。(a)创伤鼠脑照片;(b)创伤鼠脑组织切片照片

Fig. 3. Experiment pictures. (a) Photograph of TBI rat brain; (b) photograph of sliced TBI rat brain tissue

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图 4. HE染色显微图像。(a)正常鼠脑组织;(b)创伤鼠脑组织

Fig. 4. HE-stained microscopic images. (a) Normal rat brain tissue; (b) TBI rat brain tissue

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图5(a)、(b)分别示出其中一个正常鼠脑组织和一个创伤鼠脑组织的切片成像结果,成像面积为20 mm×15 mm,对应的像素大小为80 pixel×60 pixel。可以看到:正常鼠脑组织的透过率均匀,平均值为23.24%±1.44%;对于创伤鼠脑组织的创伤区域,其透过率明显偏低,仅为19.16%±0.96%,而非创伤区域的透过率则与正常鼠脑组织接近。采用干湿称重法测量创伤24 h后脑组织的水分含量,其中正常鼠脑组织中水的质量分数为79.11%±0.29%,创伤鼠脑组织中水的质量分数为84.87%±0.69%,其水分含量差异的显著性检验P值小于0.05。该结果表明创伤鼠脑的水分含量具有明显的统计学差异。经过分析后认为,创伤组织的水分含量偏高,从而导致太赫兹波成像图中创伤区域的透过率下降。

为了进一步分析鼠脑组织中创伤灶的分布区域,对13例鼠脑不同深度的切片进行了太赫兹波透射式成像,然后利用三维重构技术对不同深度的图像进行三维重构,从而更直观地展示创伤区域在鼠脑内的空间分布。考虑到每个切片在石英片基底上放置的位置以及角度的差异,需要对图像进行预处理,以校正图像。预处理过程包括两个步骤:1)旋转原始灰度图像,使每张图像中鼠脑放置的角度一致(在灰度图中,亮点表示透过率低的区域,暗点表示透过率高的区域);2)将样品区域外切矩形的中心移动到图像的中心,从而使样品位于图像的正中。以图5(a)中的正常鼠脑组织切片成像结果为例来展示预处理过程的两个步骤,如图6所示。

图 5. 切片成像结果。(a) 正常鼠脑组织;(b)创伤鼠脑组织

Fig. 5. Imaging results of slice. (a) Normal rat brain tissue; (b) TBI rat brain tissue

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图 6. 基于太赫兹波成像的三维重构预处理过程

Fig. 6. Preprocessing of three-dimensional reconstruction based on terahertz wave imaging

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在图像预处理完成后,将所有图像依次输入MATLAB程序中,绘制三维图形。三维重构结果被制成旋转动画,如图7所示。其中图7(a)~(d)和图7(e)~(h)分别表示4个以不同角度观察的创伤鼠脑和正常鼠脑的三维模型,其中:蓝色区域表示透过率较高的区域;红色区域表示透过率较低的区域,这些红色区域代表太赫兹波成像所识别出的创伤区域。由图7(a)可以看到,鼠脑内的创伤区域在最后一个切面中的面积最大,随着切片的位置与创伤位置距离的增大,创伤区域逐渐变小,直到接近颅顶位置创伤区域消失,这个结果很好地符合图3(a)中视觉所见的创伤区域位置。从创伤鼠脑的三维模型中可以清楚地看到创伤区域在大脑内的空间分布。相比之下,正常鼠脑中不存在透过率低的区域,并且其透过率分布也更加均匀。在灰度图中设定一个阈值作为创伤区域和正常区域的分界线,即可计算创伤区域的大小。以本节的创伤鼠脑模型为例,鼠脑组织共包含19221个体积元素,创伤区域共包含4340个体积元素,每个体积元素的体积约为0.25 mm×0.25 mm×0.36 mm=0.0225 mm³,从而可以计算得到三维模型中鼠脑组织的体积为432.5 mm³,创伤组织的体积为97.7 mm³,其占鼠脑组织体积的比例约为22.6%。这项研究表明了基于太赫兹波多深度切片成像的三维重构技术在生物医学精确诊断方面的潜力。

图 7. 以不同角度观察的三维模型。(a)~(d)创伤鼠脑样品;(e)~(h)正常鼠脑样品

Fig. 7. Three-dimensional models in different viewing angles. (a)-(d) TBI rat brain samples; (e)-(h) normal rat brain samples

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4 结论

采用太赫兹波透射式成像系统对自由落体击打性颅脑损伤鼠脑模型进行组织切片成像,成像结果表明,相比于正常组织,鼠脑中的创伤区域对太赫兹波具有更低的透过率。通过在鼠脑的不同深度处制备切片,获取多深度切片成像图,实现正常鼠脑和创伤鼠脑的三维重构。其中创伤鼠脑的三维成像可以清楚地反映鼠脑内部创伤区域的空间分布。由于太赫兹波在新鲜生物组织中的穿透深度较低,当前较为普遍的太赫兹波成像技术通常只能获取组织表面的信息,而无法实现三维成像。这种基于多深度切片成像的三维重构技术,是一种实现生物组织太赫兹波三维成像的可行且有效的方法,有望应用于各种病变组织的病理学发展过程研究。