单分子三维取向超分辨成像技术进展(特邀)特邀综述
1 引言
随着超分辨荧光显微成像技术的发展、新的生物标记方法与新的荧光探针的开发,以及纳米光学器件制造技术的进步,光学显微成像技术层出不穷。从最初衍射受限的系综成像,到突破衍射极限,解析纳米尺度和更多维度信息,实现超分辨三维空间成像和三维取向成像,超分辨成像技术已经逐渐成为生物物理学和生物化学等研究中精准揭示复杂生命现象不可或缺的一项重要技术。
目前的超分辨荧光成像技术大致可分为三类。第一类是基于单分子定位的超分辨显微(SMLM)技术。以Zhuang等[1]提出的STORM和Betzig等[2]提出的PALM技术为主,基于不同的闪烁机理,Sharono等[3]提出的PAINT技术和Jungmann等[4]提出的DNA-PAINT技术也是SMLM技术中常用的成像策略。基于单分子定位的超分辨荧光成像技术具有较高的空间分辨率,但需要更长的成像时间以累计更多帧数中单分子定位信息,时间分辨率较差。第二类是结构光照明显微成像(SIM)技术[5-6]。SIM技术是目前在活细胞成像领域应用最广泛的一种超分辨显微成像技术,成像速度快、光子利用率高,适用于多种荧光染料,但受其理论限制,最高分辨率大约只能达到衍射极限的1/2。第三类是由Hell等[7-8]提出的受激辐射损耗(STED)超分辨显微技术。该技术使用一束高强度的环形损耗光与激发光斑重叠成像,通过抑制损耗光斑区域内的荧光信号,达到提升荧光成像分辨率的效果;但空间分辨率的提升需要损耗激光强度,在实际应用中需要充分考虑高功率激光对样品产生的光毒性以及较严重的光漂白效应。此外,2017年Balzarotti等[9]开创性地提出最低光子通量(MINFLUX)超分辨成像策略,使用类似的环形激发光对同一个荧光分子进行多个特定位置的信号采集,以使用尽可能小的激发强度和最少的荧光光子数为目标,实现了低至1 nm的定位精度和6 nm的成像分辨率。
在不断追求更高的荧光成像空间分辨率,使得观察100 nm尺寸以下细胞微纳形貌和单分子动态逐渐成为研究活细胞生命体系的常规成像手段的同时,我们意识到在生物大分子组成生物自组装结构、参与生化反应及其分子间识别相互作用、发挥特定生物功能的过程中,往往涉及单个生物大分子构象或生物分子间相对取向的细微变化[10-11]。当把这些变化映射到空间距离域时,往往只有几纳米甚至埃米级别的位移变化,小于目前超分辨显微技术普遍能达到的空间分辨率;而如果映射到取向角度域,则会产生极其显著的角度变化[12]。因此,能够在超分辨荧光成像技术的基础上,在单个分子三维取向层面定量解析远小于光学衍射极限的生物大分子微观结构甚至单个分子构象的变化,对深入阐释相关生命过程机制具有更重要的意义。
本文以单分子荧光成像及SMLM技术为核心,阐述在此基础上发展而来的各类单分子三维取向超分辨成像技术,并重点介绍近年来的技术进展。依照技术原理及发展历程,主要分为两大类进行概述。第一类是基于荧光偏振特性开发的荧光偏振显微技术,通过分析单分子荧光激发与发射的多个偏振通道的信号强度差异,获取单分子的三维取向信息;第二类是利用点扩散函数(PSF),尤其以傅里叶面调制技术为主,将荧光探针分子的三维取向信息编码到单分子荧光图像上,借助这种“特征PSF”图样分析单分子的三维取向,进而开发出一系列对单分子三维取向敏感的单分子定位取向荧光显微术(SMOLM)。此外,还简要介绍了应用于活细胞或单颗粒的其他类型的超分辨取向成像技术。最后,针对单分子三维取向超分辨成像技术的发展现状和应用前景面临的挑战,进行总结与展望。
2 单分子三维取向成像
偏振是荧光分子吸收与辐射过程的重要特性。绝大多数有机小分子荧光探针可视为荧光偶极子,其吸收偶极矩和发射偶极矩与其分子结构(通常为共轭结构的长轴方向)有固定的对应关系。因此,测量荧光的偏振信号可以反映荧光偶极子的取向信息。当测量对象从系综水平的大量荧光探针分子降低到单分子水平时,荧光偶极取向更加直接地与单个分子的指向和摆动等三维空间动态行为密切相关。单分子的这些动态行为受到纳米-介观尺度的分子间共价、非共价相互作用及分子-微环境等多重作用力的调控,参与构成生物软物质结构、大分子自组装体系,并深刻影响发生在单个或几个分子之间的各类生物化学反应[13-15]。因此,近年来,利用单分子荧光手段开展单分子三维取向的研究受到越来越广泛的关注。
2.1 基于荧光吸收与辐射偏振调制的单分子三维取向成像方法
在单个荧光偶极子的激发过程中,其对不同偏振方向激发光吸收效率不同[16]。因此,可以通过在荧光激发光路中加入荧光偏振调制模块,将入射激发光分为正交或特定夹角的偏振方向,通过分析偏振调制荧光信号获取荧光探针的取向信息[17]。另一方面,单个荧光偶极子的辐射光场也呈线性偏振,利用偏振分光装置,将荧光发射信号分为相互垂直或更多方向(0°、45°、90°、135°)的线偏振光,得到荧光偶极子的发射取向信息[18]。
将上述荧光吸收与辐射偏振调制策略相结合,Quinlan等[19-21]报道了单分子荧光偏振(SMFP)技术。该技术将激发偏振光分为平行(p)和垂直(s)的两束偏振光束,交替激发肌动蛋白(actin)样品;产生的荧光信号经由偏振分光棱镜分为x、y偏振两路,由对应的探测器同时接收,如
S-DNA是一种特殊构象,相比于经典的(沃森-克里克)B-DNA构象更加细长[22-23]。这种构象可以通过对DNA两端施加拉力来获得,也同样适合采用荧光偏振显微技术测量单分子三维取向变化,从而进一步解析不同DNA构象间的差异。Backer等[24]使用双光束光镊对DNA进行拉伸,并使用荧光染料YOYO-1标记DNA,通过对电光调制器施加不同电压得到正交线偏振光,利用偏振方向相互垂直的激发光研究S-DNA分子中碱基对的取向变化。荧光染料镶嵌于DNA的碱基对之间,其取向会根据DNA碱基对的取向变化而变化。因此,可以根据偏振分束器解析检测到的荧光染料发射光x、y偏振分量来确定DNA取向信息。荧光偏振的计算公式如下:
式中:前缀表示激发极化,后缀表示发射极化;x/yIx/y指使用x/y偏振光激发,在x/y偏振荧光发射通道中记录的荧光强度;x/yP为正值,表示分子沿实验参考系的x轴附近排列,负值表示在y轴附近排列。
上述单分子三维取向成像研究采用正交或多个特定角度的线偏光激发单分子样品,意味着该单分子需要在一个激发序列中(如连续的两帧或多帧)保持常亮且取向固定;若与SMLM技术结合,则需要从随机闪烁的大量单分子中筛选出极小部分保持多帧常亮的单分子信号用于数据分析[25],极大地限制了基于线偏振激发调制的取向超分辨成像的效率。
另一方面,如果仅对单分子荧光发射信号进行偏振分光成像(如投影到x、y偏振通道),则可以更为便捷地与SMLM技术结合[26],但很难从中同时获取单分子三维取向、摆动行为等多个未知参数。因此,这种方法只适用对研究样品的取向分布有先验信息的情形。Cruz等[27]在2016年将单分子荧光偏振分光与SMLM技术结合,应用于双链DNA、细胞微丝等有序细丝状结构。在这类结构中,荧光探针分子具有未知但摆动受限的空间取向,依据此先验信息,实现了基于单分子偏振分光的三维取向超分辨成像。
这类荧光激发、发射偏振调控方法实验装置简洁,通常只需获取并比较不同偏振通道内荧光信号强度而非PSF图像形状,能够实现较高成像信噪比。但在与SMLM技术结合或同时获取单分子三维取向未知参数等方面存在一定局限性。
2.2 基于PSF工程的单分子三维取向成像方法
2.2.1 单分子三维取向对SMLM定位精度的影响
基于单分子定位的超分辨显微成像技术的核心之一是优化单分子的定位精度。随着超分辨技术的发展,其空间分辨率向纳米甚至埃米级提升[28],因此需要考虑单分子三维取向对定位精度的影响。大多数单分子定位技术背后的假设是单分子的真实位置对应它在成像图像平面中所采集到的光子分布的中心,但单个荧光分子以振荡电偶极子的各向异性辐射模式发射[29],在空间中产生不对称的细长的三维PSF,如
图 2. 单分子三维取向对定位精度的影响与校正。(A)具有固定取向的单分子荧光在像空间中形成了不对称的细长三维PSF,轻微的散焦会导致图像平面中的光子分布相对于真实分子位置发生横向移动[30];(B)4f光学系统示意图[33];(C)“y-phi”掩模,将方位角偏振光转换为y偏振光;(D)“y-phi”掩模将径向偏振光转换为x方向,将方位角偏振光转换为-y方向的BFP和PSF仿真示意图,标尺:200 nm[31]
Fig. 2. Single-molecule localization affected by molecular orientation. (A) Single-molecule fluorescence with a fixed orientation forms an asymmetric, elongated three-dimensional PSF in the image space, where slight defocus can cause a lateral shift in the photon distribution relative to the true molecular position[30]; (B) schematic of 4f system[33]; (C) the “y-phi” mask, which converts square polarization light into y-polarized light; (D) schematic diagram of the “y-phi” mask converting radial polarization light into x-direction and converting azimuthal polarization light into -y direction BFP and PSF simulation, scale bar: 200 nm[31]
为了消除单分子荧光三维取向对定位精度的影响,直接从单分子荧光成像的图像中准确获取单分子定位信息,Backlund等[31]设计并在4f成像系统中使用了一种基于新型高效介电超表面的掩模,称为“y-phi”掩模,如
2.2.2 离焦成像策略
尽管通过移除径向偏振分量可有效避免单分子三维取向引起的定位偏差,极大地提升获取SMLM重构图像的准确度,但这种方法会减少荧光信号强度,也会很大程度上丢失单分子取向信息。另一方面,如何精准直接地获取单分子三维取向信息,利用单分子三维取向信息理解单分子动态、单分子与微环境相互作用,逐渐成为热点研究方向。
对单分子荧光PSF图样形状而言,在某些特定取向下,其PSF会呈现与各向同性荧光分子呈现的二维高斯(或艾里)光斑迥然不同的PSF图样。在这种情况下,可以利用最大似然估计方法,从单分子PSF图样获取单分子三维取向信息[34]。不过这种方法常常对分子取向的轴向(z方向)分量不敏感,导致很难准确获取单分子的面外取向信息。另一个常用的策略是在离焦情况下成像,单分子PSF的图样形状能够更加显著地展示出单分子不同取向的差异,可以通过单帧图像中单分子PSF图样得到单分子三维取向成像[35-37]。然而离焦条件下成像会显著增加PSF尺寸,降低单分子成像信噪比,也会增加单分子定位的不准确性。
2.2.3 傅里叶面调制策略
如何人为地调控单荧光分子(或单偶极子)PSF图样,将分子的三维坐标(x、y、z)信息,取向信息中的方位角φ、极角θ,以及表征非固定偶极子摆动状态的摆动立体角Ω信息[
图 3. 单分子三维取向[38]及CHIDO技术[39]示意图。(A)方位角φ、极角θ,以及表征非固定的偶极子摆动状态的摆动立体角Ω;(B)CHIDO技术中使用的RHC与LHC后焦平面成像;(C)在标称焦平面 z = 0(顶部)和z = 300 nm(底部)处具有不同空间取向的普通PSF和CHIDO(RHC、LHC)PSF;(D)对F-肌动蛋白细丝的单分子三维定位和取向成像
Fig. 3. Schematic diagrams of single-molecule three-dimensional orientation[38] and CHIDO technique[39]. (A) Azimuthal angle φ, polar angle θ, and solid angle Ω; (B) back-focal plane images of RHC and LHC; (C) the PSFs and CHIDO PSFs at the nominal focal plane z = 0 (top) and at z = 300 nm (bottom), corresponding to five different dipole orientations; (D) single-molecule three-dimensional localization and orientation imaging of F-actin filaments
2020年,Curcio等[39]设计了一种具有抖动和定向的坐标和高度超分辨成像(CHIDO)方法。该技术使用双折射掩模对PSF进行编码,在光瞳位置放置一个应力工程光学器件(SEO)。当对其边缘施加三角对称的作用力时,可产生一种编码PSF偏振信息的双折射图案[40],其在成像光路傅立叶面上的双折射图样可以用琼斯矩阵(Jones matrix)来描述:
式中:(u,φ)是归一化的极瞳(polar pupil)坐标,当u=1时对应光瞳边缘;c为系数,取决于SEO内的应力和所使用的瞳孔半径。当c较小时,可以限制PSF的扩散,但会减少所携带的z方向位移和取向的信息量;当c较大时,则可携带更多定位取向信息,但会增加PSF扩散。在SEO之后,放置一个四分之一波片(QWP);然后,再使用沃拉斯顿棱镜(Wollaston prism)将QWP产生的圆偏振光分离成两束振动方向相互垂直的分量,形成两个图像,如
涡旋相位掩模(VPM)通常应用于STED和MINFLUX中以生成环形的激发光环[41],而Hulleman等[42]于2021年将VPM用于工程化改造单分子荧光PSF。通过在荧光成像光路的共轭后焦平面处加入涡旋相位板[
图 4. Vortex PSF成像示意图[42]。(A)成像光路图,涡旋相位板位于发射光路后焦平面,固定偶极子在相机上产生不对称环状Vortex PSF;(B)涡旋相位板;(C)不同取向的偶极子不使用涡旋相位板得到的PSF;(D)不同取向的偶极子使用涡旋相位板形成的Vortex PSF
Fig. 4. Schematic of Vortex PSF[42]. (A) Microscope with a vortex phase plate generates asymmetric donut-like shape, Vortex PSF, for fixed emitters on the camera; (B) phase profile of the vortex phase plate; (C) PSF obtained without using a vortex phase plate for dipoles of different orientations; (D) Vortex PSF formed by dipoles of different orientations using a vortex phase plate
不使用涡旋相位板且当分子处于面外取向(θ=0°)时,由于相消干涉,荧光偶极发射子形成环形PSF。
2.2.4 基于傅里叶面调制的单分子显微成像系统性策略
相比于常规或离焦PSF策略,傅里叶面相位调制方法可以以更高的精准度获取单分子三维取向(甚至包括单分子三维空间定位)信息。而作为PSF工程中的一类重要方法,傅里叶面调制策略依然有极大的空间发展出更多元的调制方法,应对不同的单分子三维取向成像应用场景。
2014年,Backer等[43]开创性地提出以傅里叶光学为主要理论框架的单分子显微成像方法,尤其考虑到SMLM技术中常常使用高数值孔径物镜以及荧光偏振分光的情形,系统性地展示了通过单分子荧光成像系统的傅里叶面调制手段将偶极子的三维取向和摆动等信息编码到单分子荧光图像中的策略。这篇文章展示了极其严格的理论推导,提出的理论框架可以更有力地指导傅里叶面调制的振幅或相位掩模设计与优化,建立完备的单分子三维取向成像仿真模型及估计算法。在这个系统性理论框架基础上,Lu等[38,44-51]逐步提出并发展了SMOLM,实现了单分子三维取向与三维定位同时精确成像。
2020年,Lu等[38]使用亲脂性荧光染料尼罗红(NR)并利用SMOLM对磷脂膜成像,发现NR的取向对磷脂膜的组成和堆积状态极其敏感,其特征取向是由脂膜的化学结构和脂质微环境决定的。首先使用偏振分束器(PBS)将荧光分为x偏振和y偏振两个通道,然后通过在后焦平面中加入空间光调制器(SLM)形成的相位掩模(Tri-spot[44]或Duo-spot)实现对发射光相位的调制,如
图 5. 利用SMOLM技术对磷脂膜微区超分辨成像[38]。(A)Tri-spot与Duo-spot相位掩模;(B)Tri-spot与Duo-spot PSF,标尺:2 µm(左)、500 nm(右);(C)NR取向受胆固醇浓度的影响;(D)NR取向受磷脂分子疏水基团的影响;(E)磷脂膜微区超分辨SMOLM成像,标尺:2 µm
Fig. 5. Super-resolution SMOLM imaging of lipid nanodomains[38]. (A) Tri-spot and Duo-spot phase masks; (B) Tri-spot and Duo-spot PSFs, scale bars, 2 µm (left) and 500 nm (right); (C) Nile red orientation with different cholesterol levels; (D) Nile red orientation with various acyl chain structures; (E) SMOLM imaging of SLB nanodomains, scale bars, 2 µm
这项工作以支撑磷脂双层膜(SLBs)为模型体系,可系统性地改变磷脂组分来控制其脂质膜的形态与内部微环境的有序度。实验发现:在缺乏胆固醇的DPPC中,NR表现出倾斜取向,且具有较大的摆动角;随着胆固醇浓度增加至40%,SLBs的有序度增加,引起NR极角和摆动立体角急剧减小,如
2021年,Ding等[45]将Vortex PSF应用到SMOLM中并对双层脂膜中的NR分子进行单分子三维取向成像。该方法在成像光路后焦平面处加入由SLM生成的VPM,并使用偏振分束器将荧光发射信号分为x、y两个正交偏振通道来提高取向成像的灵敏度,如
图 6. 基于偏振涡旋PSF的SMOLM成像原理图[45]。(A)成像装置示意图;(B)具有相同取向和不同摆动各向异性的单分子偏振涡旋PSF,标尺:300 nm;(C)淀粉样蛋白聚集形成的纤维状结构中,探针分子的摆动各向异性成像,标尺:1 µm
Fig. 6. Principle for polarized vortex imaging[45]. (A) schematic of the optical setup; (B) representative dipole orientations (top) and corresponding polarized vortex PSFs (bottom), scale bar, 300 nm; (C) molecular binding orientations and rotational diffusion on an amyloid fibrillar network, scale bar, 1 µm
使用偏振涡旋PSF和NR对SLBs进行PAINT成像,发现DPPC SLBs中的NR的旋转摆动表现出很大的灵活性,并且分子沿着平行于酰基链的方向(α)摆动比垂直方向(β)表现出更多的旋转扩散;然而,在含有高胆固醇浓度的DPPC SLBs中,NR的摆动变得更加各向同性。在使用NR对淀粉样蛋白amyloid-β(Aβ42)的成像中,该方法可以有效区分淀粉样蛋白聚集形成的延伸纤维状结构和寡聚球状结构中探针分子的摆动各向异性特征。在纤维状结构中,局部的NR分子方位角φ的标准差较小,即NR分子的取向角φ趋近于一致,并且趋向于各向异性摆动,如
2022年,Zhang等[50]提出一种径向-方位偏振(raPol)显微镜。该方法使用了一种类似于y-phi掩模的涡旋半波片(VWP)[
图 7. raPol显微镜[50]。(A)放置在成像系统的后焦平面处的VWP;(B)具有不同取向荧光分子的径向(红色)和方位角(蓝色)偏振PSF,标尺:500 nm;(C)raPol与常规xyPol PSF方法对单分子三维取向与摆动测量精度对比;(D)在高胆固醇条件下,尽管探针分子的取向和摆动强烈受限,但表现出更加明显的平移扩散行为,标尺:50 nm
Fig. 7. raPol microscope[50]. (A) VWP placed at the back focal plane of the imaging system; (B) representative radially (red) and azimuthally (blue) polarized PSFs of rotationally fixed molecules, scale bar, 500 nm; (C) detection and orientation estimation performance of raPol and xyPol PSFs; (D) rotational and translational diffusion of single molecules with increasing cholesterol concentration, scale bar, 50 nm
为了更有效地利用荧光光子,研究人员开发了一种空间紧凑的偶极扩散函数(DSFs),以实现更高精度和准确度的单分子三维位置和三维取向(6D)成像[46]。2023年,Zhang等[47]在raPol的基础上提出一种结合了偏振调制和光瞳分裂的技术,称为径向和方位偏振多视角反射(raMVR)显微镜。与单分子6D荧光成像技术相比,raMVR方法具有各向同性的分辨率,并且具有良好的抗像差能力。首先,使用VWP和PBS将径向和方位两个分量的偏振光分离到两个正交偏振通道,如
图 8. raMVR显微镜[47]。(A)成像装置示意图;(B)raMVR技术中使用的玻璃金字塔和空气金字塔反射镜及光束反射示意图;(C)相机在x,y偏振方向上得到的4个成像通道,标尺:20 µm;(D)raMVR方法得到的单分子三维取向DSF成像,标尺:500 nm;(E)半径为150 nm、350 nm、1000 nm球形磷脂膜的6D定位与取向超分辨成像;(F)HEK-293T细胞的6D定位与取向超分辨成像,标尺:2 µm
Fig. 8. raMVR microscope[47]. (A) Schematic of the raMVR setup; (B) the pyramidal and air pyramid mirrors in raMVR; (C) raw images projected on the detectors, scale bar, 20 µm; (D) representative DSF in each channel for one molecule, scale bars, 500 nm; (E) 6D SMOLM images of lipid-coated spheres with with radii of 150 nm, 350 nm and 1,000 nm; (F) 6D SMOLM images of HEK-293T cell, scale bar, 2 µm
通过每个通道中形成DSF的不同亮度,可以区分每个单分子的取向和摆动程度,每个通道中的DSF会随着单分子三维取向轴向位置的变化而产生横向移动,如
2.3 应用于活细胞或单颗粒的超分辨取向成像技术
除了基于单分子定位的超分辨三维取向技术之外,近年来也出现了许多其他引人瞩目的超分辨取向成像研究方法。例如,Xi课题组[52]于2016年提出超分辨偶极取向映射(SDOM)方法,通过调制偏振激发光,可从更少的荧光分子中有效地解析出荧光偶极子的取向。这种荧光偏振显微技术具有亚衍射极限的分辨率,成像速度可以达到每秒5帧,更适用于活细胞成像,使得获取超分辨率高动态的细胞结构成像成为可能。2019年,Xi与Dai课题组[53]共同将荧光偏振调制方法和结构光照明技术结合,提出偏振SIM(pSIM)技术,实现了在超分辨尺度下解析生物分子的取向与结构信息,并对该技术持续迭代更新,与三维SIM结合,实现了快速的偏振三维SIM(polar-3DSIM)成像[54]。随后,Xi与Jin课题组[55]报道了光谱和偏振光学层析成像(SPOT)技术。SPOT可同时从荧光强度、光谱和偏振三个维度解析膜的形态、极性和相组分等信息,用于活细胞亚细胞尺度的脂质组学研究。SPOT的原理是通过两个或多个相移结构照明,然后使用HiLo方法将每个不同图样方向的高频低频信息融合。类似于pSIM技术,SPOT也需要使用3个不同方向的结构光,采集6幅图像[53],但比常规的SIM需要的9幅图像更少。使用SPOT方法实现了对细胞分裂过程中多细胞器相互作用活动的实时监测,并成功揭示了它们在质膜分离、隧道纳米管形成和线粒体嵴解离过程中复杂的脂质动力学。
在单颗粒催化成像相关研究中,2019年,Fang课题组[56]将单分子荧光偏振显微镜应用于纳米限域效应的单分子三维取向研究。单分子偏振成像实验在具有多层结构的纳米催化剂上进行,该催化剂由透明的固体SiO2核、具有线性孔道结构的多孔SiO2壳和夹在核壳之间的铂纳米颗粒组成。其中,非荧光的反应物分子荧光红染料(AR)会在纳米孔内转化为具有高荧光活性的产物——试卤灵(Re)。Re分子的成像结果表明,Re分子的长轴平行于线性纳米孔方向,孔内分子的取向受到限制;AR分子结构与Re分子相似,这种取向偏好性也适用于AR分子。由此解释AR吸附强度降低是由接近并吸附在具有固定取向的铂纳米颗粒造成的。该研究在核壳纳米催化剂上发现了不寻常的催化活性,即在纳米多孔壳存在的情况下吸附强度较低但催化活性较高,并在单分子水平上定量解释了纳米限制对纳米多孔材料化学转化的影响。
3 总结与展望
从早期的偏振调制方法,到PSF工程与超分辨显微成像技术的结合,单分子三维取向成像技术对单个探针分子的三维空间取向与三维空间定位的精准度均得到了极大的提高,在解析生物样品的纳米尺度结构与有序度、生物大分子构象等方面展示出独特的技术优势。成像技术的发展为我们提供了更多可选择的工具,然而将单分子三维取向超分辨成像技术更广泛地应用于生命科学、化学、材料等领域依然存在多重挑战,需要未来更深入的研究和可信的数据来展示该技术多元的应用场景和在科学与应用层面的重要性。
首先,需要发展适用于单分子三维取向超分辨成像的荧光标记策略。通常情况下,待研究生物大分子对象本身是没有荧光信号的,需要使用有机小分子荧光探针或荧光蛋白对成像目标物进行共价[如(d)STORM、PALM技术]或非共价(如PAINT技术)标记;如果涉及特异性标记,还常常需要使用多个较大尺寸的抗体蛋白。在SMLM技术中,这样会导致荧光标记位点与待成像目标物存在几纳米或更小的间距;这个距离常常小于目前SMLM技术的定位精度,所以一般情况下不会对SMLM成像结果产生影响。然而,当测量参数转变为分子三维取向时,例如在基于(d)STORM的SMOLM技术中,对待成像目标物的共价标记需要使用双/多连接基团修饰探针,以确保小分子荧光探针的取向与待研究目标物的空间取向保持平行或固定的角度关系[12,57]。而目前最常使用的荧光探针修饰方式只使用单个连接基团,由于单连接基团在三维空间内存在自由转动,SMOLM技术只能获取该探针的三维取向,而不是待研究目标物的三维取向。在基于PALM的SMOLM技术中,需确保荧光蛋白的荧光团与待标记目标蛋白之间为刚性连接[53]。在基于PAINT的SMOLM技术中,由于荧光探针与待研究目标物仅通过短暂、随机的非共价相互作用,所以更需要大量筛选不同种类的荧光探针,以选取对待研究目标物三维取向变化更为敏感的荧光探针[38],或者设计、合成对三维取向敏感的新型SMOLM探针。因此,在SMOLM技术中,为了获取有意义的单分子三维取向信息,一定要确保荧光探针的三维空间取向与待研究生物大分子、自组装体的取向或构象存在固定或可知的定量关系,这是制约单分子三维取向超分辨成像应用的难点和关键因素。
其次,需要提升单分子荧光亮度或成像信噪比。在单分子三维取向成像策略中,使用荧光偏振分光将单分子荧光信号分为多个偏振通道,或利用PSF工程将单分子PSF转变为多个亮点或更大尺寸的图样,都会不同程度地降低SMOLM原始图像信噪比,对单分子识别率、定位精度、三维取向计算精准度带来负面影响。对于某些在SMLM技术中表现优秀的荧光探针,应用于SMOLM成像则会带来较差的信噪比甚至导致成像图像不可用。目前有一些实例,通过优化筛选荧光探针,得到更加适合SMOLM技术的更亮的荧光探针。例如,2020年,Mora等[58]提出一种比硫黄素T(Thioflavin T)更适用于β-淀粉样蛋白(Aβ)成像的荧光探针SYPRO Orange,解决了Thioflavin T荧光强度低和背景信号高等问题,并进一步由Manoj Kumbhakar应用于SMOLM成像[51]。
再次,存在将单分子三维取向超分辨成像应用于活细胞成像的难点。尽管目前已有SMOLM技术开展了对活细胞三维取向的初步成像尝试[47],但受到样品复杂程度、探针浓度、荧光背景干扰、成像速度等因素的影响,将SMOLM等技术应用于活细胞成像,尤其用于解析胞内纳米尺度结构时,依然充满挑战。为了应对该挑战,一方面可以借鉴在活细胞SMLM成像中,已被广泛应用的(d)STORM和PALM等实验方案策略[59-60],以提升单分子荧光成像信噪比。另一方面,活细胞内部复杂微环境会使单分子三维取向荧光信号偏离理论PSF,使精准解析单分子三维取向信息及其实时动态变化变得更加困难。基于单分子定位的SMOLM方法往往需要较长的成像时间,其对于三维空间和三维取向的分析精度较高,但在解析高动态的生物分子相互作用过程具有一定困难。利用深度学习等策略为化解上述困难提供了新颖且有效的破题思路[61-62]。Wu等[63]于2022年展示的Deep-SMOLM技术,实现了对单分子三维取向和二维空间定位的精准快速解析,对于含有高度重叠PSF的原始SMOLM成像数据,分析处理时间比迭代估计方法提速了近10倍。2023年,Shechtman课题组[64]提出一种基于深度学习的SMLM数据重建方法DBlink,实现了活细胞的高动态过程超分辨成像。
最后,实现多色成像或拓展单分子三维取向成像在波长维度的信息也是从技术层面上将其推广应用于复杂生命过程研究的趋势之一。例如,Auer等[65]将DNA-PAINT与FRET技术结合,实现了更加快速、更低背景的单分子定位成像;Ostersehlt等[66]于2022年提出DNA-PAINT与MINFLUX技术结合,将MINFLUX技术扩展到多个分子靶标,实现了线粒体三色成像。
总之,随着超分辨成像技术的快速发展,基于单分子定位的单分子三维取向超分辨成像技术为我们在单个分子的层次上研究多维度、复杂的单分子行为提供了更多的可能性。未来,在技术层面提升单分子三维取向超分辨技术的成像精准度、进一步推进技术应用的广度和深度等方面具有持续广阔的发展前景。
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