1 引言

表面等离子体是指金属表面存在的自由振荡电子与入射光子相互作用所产生的沿着贵金属(如Au和Ag等)表面传播的一种表面波,表面等离子体这一概念由Stem等^[1]于1960年首次提出。光学局域表面等离子体共振(LSPR)是一种光波作用于比其尺寸小得多的纳米颗粒表面上所产生的等离子体共振光学现象,当入射光频率与金属自由电子集体振荡频率相匹配时,就会产生LSPR,使得纳米颗粒表面附近的电场大大增强,且对光的吸收和散射最大,但随着表面距离增大,电场增强迅速消失。对于贵金属纳米粒子,共振发生在可见光波段^[2-3],因此与发生在连续光滑的金属膜表面的表面等离子体共振(SPR)不同^[4-6],LSPR发生在纳米尺度范围的贵金属颗粒表面。可见,LSPR既不需要棱镜等复杂的光学耦合器件,又保留了SPR高灵敏度、高选择性、无需标记的优点,还使得系统更加紧凑,且成本更低,在生物传感方面具有明显优势^[7-8]。金纳米粒子(AuNPs)具有极强的LSPR效应,在紫外-可见光波段能表现出很强的消光现象(包括吸收和散射等),且消光光谱的特征与AuNPs的形状、尺寸、周围环境的折射率等因素密切相关^[9-12],因此通过调控这些参数的变化即可实现生物分子传感检测。此外,制备AuNPs的方法成熟,过程简单,且AuNPs的稳定性和生物相容性好,在生物传感分析领域应用广泛^[13-17]。

根据LSPR的实现方式,构建LSPR光谱信号获取装置可根据实验所需自主设计,LSPR检测装置的构建主要包括3个部分,即光源(白光或激光)、样品机构和光谱仪。目前,LSPR检测方式主要包括吸收光谱法、透射光谱法、反射光谱法及暗场光学法^[18]。其中,透射光谱法是记录光透过样品时与纳米颗粒作用后得到的纳米粒子的消光光谱,包括吸收光谱和散射光谱。实验室最为常见的透射光谱采集装置是商品化的紫外-可见分光光度计,它通常有两个通道,一个为参比通道,另一个为样品检测通道。由光源发出的全波段连续光谱经过滤光片后变成一束单色光,再通过光栅可获得单色光的连续光谱,该过程需要通过步进电机控制滤光片的更换,以实现全波段波长扫描,因此光谱数据的采集速度较慢。

本文采用透射光谱检测方式构建了一套由宽带光源、衰减器、多模光纤、光纤光谱仪和多通道样品池定位机构等组成的多通道LSPR实验装置,获得了粒径为5.0,13.5,25.5,41.0 nm 的AuNPs的消光光谱,采用Savitzky-Golay平滑算法对原始光谱数据进行预处理并建立拟合曲线,获得了光学LSPR峰值波长,分析了粒径大小和环境介质折射率对LSPR峰值波长的影响。该装置在透射光谱获取过程中,无需像商品化仪器分光光度计那样进行波长扫描,大大节省了检测时间,为开展LSPR分析提供了一种新方案。

2 实验部分

2.1 多通道精确定位光学LSPR装置的构建

图1(a)为多通道精确定位光学LSPR装置示意图。该LSPR装置由宽带光源(波长范围为360~2000 nm,供电电压+5 V)、衰减器(Ocean Optics公司)、多模光纤(传输光谱范围为200~1100 nm)、光谱仪 (USB2000+型,Ocean Optics公司) 及多通道精确定位机构组成。其中的多通道精确定位机构如图1(b)所示,它可以分别沿着两条相互垂直的导轨滑动,每条导轨对应于微孔板相互垂直的两个方向(x和y),两条导轨上分别有12个和8个位置限位孔,可与生物分析中常用的96孔板匹配使用,实现多个样品的同时测定。在每条导轨的侧壁内,各嵌有一个弹性滚珠,每移动一个等距的位置,滚珠就靠弹簧的弹性推力卡在限位孔里,使样品池不能移动,从而实现样品池的精确定位。当样品池移动到末端限位孔位置后,碰到挡块,不能继续向前移动,只能反向移动。进行测量时,由光源发出连续波段的光谱,经衰减器调节合适的光强后照射到样品上发生相互作用,透过样品的光经光纤传输到光谱仪,采用光谱仪软件SpectraSuite进行原始光谱信号的采集。

2.2 不同粒径AuNPs的合成

采用粒径分别为5.0,13.5,25.5,41.0 nm的AuNPs对上述实验装置进行验证,其中粒径为5.0 nm的AuNPs购于英国BBI Solutions公司,其余3种粒径的AuNPs采用柠檬酸三钠还原法合成得到。该方法最早在1951年由Turkevich等^[19]报道使用,后于1973年由Frens^[20]进行改进,是目前在生物分析领域使用最广泛的制备方法,即:在氯金酸(HAuCl₄)水溶液沸腾的条件下,加入不同量的还原剂(柠檬酸三钠)来调控AuNPs的结晶成核和晶体生长过程,从而可以制备得到粒径为10~147 nm且分散良好的AuNPs。表1给出了参考Frens所提方法合成AuNPs所用试剂以及AuNPs的粒径,其中的HAuCl₄、柠檬酸三钠购买于国药集团化学试剂北京有限公司。

图 1. (a)多通道精确定位LSPR实验装置示意图;(b)多通道精确定位机构

Fig. 1. (a) Schematic of multi-channel precision alignment LSPR experimental setup; (b) multi-channel precision alignment system

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2.3 不同浓度葡萄糖溶液折射率的测定

配制5种不同浓度的葡萄糖溶液,在室温条件下,采用阿贝折射仪进行折射率及其相应的浓度测试,得到的质量分数分别为0%、5.6%、10.8%、21.0%和25.7%,相应的折射率分别为1.3305、1.3412、1.3490、1.3655和1.3735。可见,随着葡萄糖浓度增加,折射率逐渐增大,二者具有良好的线性关系,其线性方程为n_r=1.33114+0.168C,其中n_r为折射率,C为葡萄糖的质量分数,线性相关系数R=0.999。

2.4 不同粒径AuNPs消光光谱的测量

分别采用粒径为5.0,13.5,25.5,41.0 nm的AuNPs进行LSPR评价,移取待测样品200 μL放入微孔板中,将微孔板放在多通道精确定位光学LSPR实验装置中进行光谱测试。测试前打开光源,预热30 min使光源达到稳定状态后再开始测试。

3 光谱分析方法

采用光纤光谱仪进行光谱数据采集时,噪声的存在会对光谱信号的分析产生影响。Savitzky-Golay平滑算法最早由Savitzky等^[21]于1964年提出,并发表在Analytical Chemistry杂志上,之后该算法被广泛地应用于数据流平滑除噪,是一种局域多项式最小二乘法拟合的滤波方法。由于该算法能最大限度地保留相对光谱的极值和宽度等分布特性,在光谱分析领域被广泛应用^[22-23]。可以通过调整参数(拟合阶次、窗宽大小)对不同的光谱数据进行处理,优化滤波效果。

采用Savitzky-Golay算法滤波处理一组以n=0为中心的2M+1个数据(窗宽),用(1)式所示的多项式进行拟合:

y(n)=∑k=0Naknk,(1)

其残差为

εN=∑n=-MM[y(n)-x(n)]2=∑n=-MM∑k=0Naknk-x(n)2。(2)

在(2)式中,若ε_N最小,则需有关a_k的偏导数为零,即

∂εN∂ak=∑n=-MM2ni[y(n)-x(n)]=∑m=n-MM2ni∑k=0Naknk-x(n)=0,(3)

式中:i=0,1,…,N。(3)式简化后可得

∑k=0N∑n=-MMni+kak=∑n=-MMnix(n)。(4)

令A=(a_ni),a_ni=nⁱ,-M≤n≤M,0≤i≤N,B=A^TA,则可得

bk=∑n=-MMainank=∑n=-MMni+k=bki。(5)

因此,

Ba=ATAa=ATx,(6)a=(AT·A)-1ATx=Hx,(7)

式中:H为所求的卷积系数。

将实验得到的原始光谱数据采用Savitzky-Golay平滑算法进行处理,再采用多项式对平滑后的光谱数据进行拟合得到光谱曲线的多项式方程,其形式为:Y=p₁x⁴+p₂x³+p₃x²+p₄x+p₅,通过对曲线方程求解即可得到LSPR的峰值波长。

4 结果与讨论

4.1 多通道样品池通道间一致性评价

采用粒径为13.5 nm的AuNPs对实验装置的通道一致性进行评价。根据文献报道,粒径为13.5 nm的AuNPs的最大吸收波长在520 nm附近。按照2.4节的实验过程,记录微孔板不同位置处粒径为13.5 nm的AuNPs在520 nm处的吸光度,得到的数据分布如图2所示。根据吸光度的差异将微孔板分为3个区域:区域I、区域II和区域III。其中:区域I为微孔板中间区域,区域II和区域III位于微孔板x轴的边缘。由图2可以看出:区域I中AuNPs的吸光度均值约为0.47,比较均匀;区域II中AuNPs的吸光度相对较小,最小值为0.45;区域III中AuNPs的吸光度相对较大,最大值为0.49。可见:区域II和区域III中AuNPs的吸光度相对区域I略有偏差,相对误差为4.26%,表明该装置通道间具有较好的一致性。

4.2 不同粒径的AuNPs在相同介质中的消光光谱

测量粒径为5.0,13.5,25.5,41.0 nm的AuNPs在水介质环境下的消光光谱,按照上述的光谱分析方法拟合得到的光谱曲线如图3(a)所示,拟合系数见表2,得到的不同粒径AuNPs对应的LSPR峰值波长λ_max分别为513.93,519.10,524.20,528.95 nm,λ_max与粒径大小D线性相关,见图3(b),线性方程为λ_max=512.83243+0.41D,R=0.983。此外,测定了上述4种AuNPs在质量分数为5.6%的葡萄糖溶液中的消光光谱,得到的光谱曲线如图4(a)所示,拟合系数见表3,对应的λ_max分别为514.03,520.15,524.73,529.30 nm,λ_max与D之间的线性方程为λ_max=513.05333+0.41596D,如图4(b)所示,R=0.978。由以上实验结果可以看出,在相同的介质环境下,随着AuNPs粒径增大,LSPR波长发生红移,且LSPR波长与粒径大小线性相关。

图 2. 粒径为13.5 nm的AuNPs在微孔板相应位置的吸光度分布

Fig. 2. Absorbance distribution of AuNPs with diameter of 13.5 nm at the corresponding positions of microplates

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图 3. 水介质环境下不同粒径AuNPs的消光光谱以及粒径与LSPR峰值波长之间的关系。(a)消光光谱;(b)关系

Fig. 3. Extinction spectra of AuNPs with different diameters and the relationship between LSPR peak wavelength and the diameter of AuNPs in water medium. (a) Extinction spectra; (b) relationship

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4.3 25.5 nm和41.0 nm的AuNPs在不同介质环境下的LSPR波长

为了考察外部环境折射率对AuNPs的LSPR波长的影响,首先测量粒径为25.5 nm的AuNPs在质量分数分别为0%、10.8%、21.0%、24.5%葡萄糖溶液介质环境下的消光光谱,获得的光谱曲线拟合系数见表4,求解得到对应的LSPR波长分别为524.20,525.07,526.25,526.77 nm,环境介质折射率与LSPR波长之间的线性拟合曲线如图5中的曲线A所示,线性方程为λ_max=445.0404+59.45896n_r,R=0.991;随后,进一步考察了粒径为41.0 nm 的AuNPs在上述不同浓度葡萄糖溶液介质环境下的消光光谱,获得的光谱曲线拟合系数见表5,求解得到对应的峰值波长分别为528.95,530.50,531.50,532.00 nm,环境介质折射率与LSPR波长之间的线性拟合曲线如图5中的曲线B所示,线性方程为λ_max=435.4057+70.37505n_r,R=0.995。可以看出:AuNPs的LSPR峰值波长与折射率密切相关,且粒径越大,折射率灵敏度越高,这与Drude模型的预测结果相一致^[24]。对于25.5 nm和41.0 nm这两种粒径的AuNPs,实验得到的折射率灵敏度S_RI分别为59.46 nm/RIU和70.38 nm/RIU。

图 4. 质量分数为5.6%的葡萄糖介质环境下不同粒径AuNPs的消光光谱及粒径与LSPR峰值波长之间的关系。(a)消光光谱;(b)关系

Fig. 4. Extinction spectra of AuNPs with different diameters and the relationship between LSPR peak wavelength and the diameter of AuNPs in glucose solution medium with mass fraction of 5.6%. (a) Extinction spectra; (b) relationship

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图 5. AuNPs的LSPR峰值波长与环境折射率之间的关系

Fig. 5. Relation between AuNPs LSPR peak wavelength and environmental refractive index

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5 结论

本课题组基于光学LSPR透射检测方式,搭建了一套多通道光学LSPR分析装置,研究了LSPR波长与AuNPs粒径、环境折射率之间的关系。实验结果表明:在相同的介质环境下,随着粒径增大,LSPR波长发生红移,且粒径与LSPR波长具有较好的线性关系;同时,在粒径大小一定的条件下,LSPR波长与介质环境的折射率密切相关;在折射率变化量相同的条件下,粒径越大,LSPR波长移动越大,即折射率灵敏度越高。该装置将多通道样品池精确定位机构与光纤光谱仪相结合,成本较低,光谱的获取无需波长扫描过程,测试速度快,为光学LSPR分析提供了一套新的检测系统。