荧光光谱法结合BLLS/RBL用于快速检测水中喹诺酮类抗生素 下载: 1243次
1 引言
喹诺酮类抗生素,又称吡酮酸类或吡啶酮酸类,是人工合成的一类人畜通用的抗菌药物,由于该类抗生素具有抗菌谱广、抗菌活性强,并且与其他抗菌药物相比,无交叉耐药性、毒副作用小等特点,在畜牧业、水产养殖业中被广泛应用,其中包括鸡、鸭、猪、羊、鱼等生物的疾病防治[1]。但是不乏一些农场主为了快速达到治疗效果,过度滥用抗生素,其用量严重超出国家的用药标准,而动物排泄出具有抗生素残留的废物、废水,如果没有得到规范处理,进入地表后会进一步污染土壤和生活用水,人们长时间食用受抗生素污染的食物及饮用水,抗生素会在体内不断积累,造成严重的耐药性,影响疾病治疗,严重者会出现恶心、呕吐、头痛等症状,危害人们的身体健康[2]。
目前,对抗生素的残留检测比较常见的方法有高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)等。高凯等[3]采用高效液相色谱法对黑臭河体中磺胺类、四环素类、喹诺酮类共计7种抗生素进行了检测研究,回收率均在40%~80%之间,其中喹诺酮类物质保持了较高的回收率;温颖婉等[4]利用液相色谱-串联质谱法同时检测了化妆品中17种喹诺酮类抗生素,检出限为0.2~7.9 ng·mL-1,平均回收率为72.9%~119.6%。这些方法不仅回收率和检出限偏低,而且对样本的预处理、实验人员的操作要求较高,对样本的提取过程复杂不易操作[5]。
本文采用的三维荧光光谱分析法,具有灵敏度高、选择性好、不需要复杂的实验样本预处理的特点[6]。采用小波优化集合经验模态分解(EEMD)方法消除了光谱中的噪声干扰,针对三种喹诺酮类抗生素的混合溶液出现的光谱重叠问题,采用双线性最小二乘/残差双线性方法(BLLS/RBL)对抗生素混合溶液进行了定性定量分析,并将分析结果与传统的平行因子分析法(PARAFAC)的结果进行对比,结果表明BLLS/RBL的定量结果更为准确。
2 原理方法
2.1 BLLS/RBL算法
BLLS算法是二阶校正算法中的一种,该方法的主流思想是采取两步校准-预测的方式,其中浓度预测由最小二乘法完成。BLLS算法在校准步骤中引入浓度信息,不包括未知样本的数据,其目的是便于估算单位质量浓度(Sn)下特定校准分析物(标号为n)的单组分浓度[7]。
1) 将校准数据矩阵Xc,i进行矢量化处理,每个矩阵的大小为J×K,并将其分组为JK×I的矩阵,记作Vx,即
式中: vec表示展开操作。
2) 采用直接最小二乘法(LS)获得纯分析物的信息,该运算类似于一阶经典最小二乘多元校正法。
式中:Y是一个I×Nc的矩阵,包含了校准分析物的标准浓度, Nc为校准分析物的数量。Vs的大小为JK×Nc,包含所需的Sn矩阵,采用矢量化形式表述
3) 采用奇异值分解轮廓估计的方法来获取激发光谱和发射光谱的二维轮廓图。Sn矩阵中的二维轮廓图,通过对每个Sn矩阵的单组分进行奇异值分解(SVD1)来获取。该分解过程是对展开的vec(Sn)进行适当重构,即
式中:kn为Sn的第一个奇异值;vn为Sn的左特征向量,是一个J×1的列向量;wn为Sn的右特征向量,是一个K×1的列向量。为了完成校准过程,每个vec(Sn)需要根据kn,vn,wn进行重建,即
式中:表示克罗内克乘积。
校准后,如果未知样品不包含干扰物质,则可直接采用最小二乘法来估计测试样品中的浓度,浓度估计公式表示为
式中:Xu为测试样品数据,大小为J×K;yu为一个Nc×1向量,包含校准分析物Nc的估计浓度;
如果测试样品中出现干扰成分,则通过残差双线性化(RBL)处理干扰成分,得到干扰成分轮廓,并将其合并到Scal中,该步骤可表示为
式中,通过残差矩阵Ec的最小化过程获得轮廓cint和bint,该过程可表示为
在最小化过程中,通过残留矩阵Ec的奇异值分解来估计干扰成分的轮廓,该值通过减去分析物对总信号Xu的贡献度来获得,即[8]
2.2 PARAFAC分析
PARAFAC分析法是基于三线性模型理论,采用交替最小二乘原理实现的一种多维数据的分解算法,该算法可以从数据中提取出感兴趣的物质信息,并根据数据的变异、相加和选择特性来实现对多组分混合物的分解,以达到多组分混合物质的定性鉴别和浓度定量分析的目的。具体算法原理及公式详见文献[ 9]。
2.3 小波优化EEMD算法
小波优化EEMD算法是,首先根据EEMD方法分解得到若干高频和低频本征模函数(IMF)分量,利用原始信号与IMF分量作相关性分析,相关系数小的分量利用小波阈值法进行二次去噪,另一部分分量保留不作处理,最后对信号进行重构得到去噪后的信号。该算法最大程度地保留了原始光谱信息,达到了很好的去噪效果。具体原理及公式详见文献[ 10]。
2.4 品质指数
品质指数(FOM)是用来对比算法结果优劣的重要评价指标,在本研究中,引入灵敏度(SEN)、检出下限(LOD)、回收率(Recovery)和均方根误差(RMSE)来衡量算法的处理结果的准确性[11]。
二阶校正模型的灵敏度(SEN),用来表示单位浓度的净分析信号,表达式为
式中:“*”表示哈达玛积(Hadamard);hn在BLLS/RBL算法中取值等于(5)式中的kn,在PARAFAC算法中,用于表示将载荷转换为浓度的参数。
检出下限(LOD)表示在一定置信度下,可检测的最低分析物浓度,表达式为
式中:NSD(0)为低浓度样本预测浓度的标准偏差。
回收率(Recovery)和均方根误差(RMSE)表示样本浓度真实值与预测值的接近程度,表达式分别为
式中:yi表示样本的实际浓度值;y'i表示样本的预测浓度值;N代表样本个数。
3 实验研究
3.1 主要仪器与试剂
实验所用的喹诺酮类抗生素标准品,包括FLU标准品(纯度≥98%)、ENR标准品(纯度≥98%),LVFX标准品(纯度≥98%),均购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;实验所用试剂采用SDS(化学纯),购买于国药试剂网;实验用水均为超纯水,由优普纯水仪(成都优普仪器设备有限公司)制备。
实验所用称量器械为FA1004精密电子秤;使用FS920稳态荧光光谱仪(英国爱丁堡公司)完成三维荧光光谱数据的采集;使用HY-5A 回旋振荡器(国华电器有限公司)加速样本溶解。
FS920参数设置:激发波长范围设置为250~400 nm,步长为5 nm;发射波长范围设置为340~600 nm,步长为2 nm。设置发射波长滞后激发波长10 nm,以消除一级瑞利散射干扰。入射狭缝和出射狭缝设置为2 mm,样品室温度设置为恒定20 ℃。
3.2 实验过程
准确称量10 g SDS 标准品,并将其转移至烧杯中,用适量超纯水溶解,水浴加热10 min使样品充分溶解,待溶液冷却至室温后用超纯水定容至100 mL棕色容量瓶中,得到质量浓度为100 g·L-1的SDS储备液,并于4 ℃避光条件下保存。取5.5 mL SDS储备液并用超纯水定容至100 mL棕色容量瓶中,得到质量浓度为5.5 g·L-1的SDS工作溶液。
准确称量FLU、ENR、LVFX标准品各0.01 g,分别用5.5 g·L-1的SDS胶束溶液定容至100 mL棕色容量瓶中,回旋振荡20 min,使样品得到充分溶解,分别得到质量浓度为0.10 g·L-1的三种抗生素标准品的储备液,并于4 ℃避光条件下保存。取1 mL的FLU标准品的储备液、0.1 mL ENR和LVFX标准品的储备液,并分别用5.5 g·L-1的SDS胶束溶液定容至100 mL的棕色容量瓶中,回旋振荡10 min,得到100 μg·L-1的FLU工作溶液,10 μg·L-1的ENR工作溶液,10 μg·L-1的LVFX工作溶液。
分别取适量上述标准工作溶液用SDS胶束溶液定容于10 mL棕色容量瓶中,获得不同浓度的标准待测溶液,实验共配制了20组三种喹诺酮类抗生素的混合水溶液残留样本。其中,C1-C13为不同浓度的校正集样本,T1-T7为不同浓度的预测集样本,如
表 1. 校正样品和预测样品浓度
Table 1. Concentration of calibration and prediction samplesμg·L-1
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4 结果与讨论
4.1 光谱预处理
用荧光光谱仪在设定的仪器参数下,对实验样本进行光谱扫描,得到不同物质不同浓度的混合溶液荧光光谱数据,数据为20×131×31的三维矩阵。以测试样本T1为例:首先对光谱中常见的拉曼散射和二级瑞丽散射干扰进行去除,如
图 1. 混合溶液T1样本的等高线图。 (a)去噪前;(b)去噪后
Fig. 1. Contour maps of sample T1 of mixed solution. (a) Before denoising; (b) after denoising
4.2 抗生素混合溶液的定性鉴别
在对混合组分样本进行定性分析之前,首先对校正集C11、C12、C13各单组分物质进行荧光特性分析,其荧光光谱等高线图如
按照2.1节中BLLS/RBL方法的原理进行数据建模。1)将设定的校正集样本数据进行矢量化处理,并将数据进行分组,采用直接最小二乘法对校正集样本各组分的标定浓度与其荧光强度进行拟合,得到校正集浓度拟合曲线,用于完成后续的浓度预测工作;2)采用奇异值分解轮廓估计法对每个单组分矩阵的奇异值和特征向量进行展开和重构,以得到各组分解析光谱的二维轮廓图,至此完成模型的建模过程。同样地,将样本数据利用PARAFAC方法建模,用于后续的结果比较。在实际情况中,样本组分数是未知的,为此采用核一致值诊断法(core consistency diagonosis, CORCONDIA)[12]对样本集含有的组分数进行估计,结果如
图 2. C11、C12、C13样本等高线图。 (a) LVFX; (b) ENR; (c) FLU
Fig. 2. Contour maps of samples C11, C12 and C13. (a) LVFX; (b) ENR; (c) FLU
图 3. 核一致值诊断法确定样本组分数
Fig. 3. Determination of sample group score by core consistency diagnosis
将样本组分数设定为3,输出模型的定性鉴别结果,结果发现采用PARAFAC和BLLS/RBL两种方法解析出的轮廓图基本一致,均能较好地定性地区分出抗生素混合溶液的各个组分。为了更直观地观察解析光谱的准确性,将C11、C12、C13三种单组分物质的荧光数据也输入到模型中,得到各单组分的真实光谱,其结果如
图 4. BLLS/RBL解析出的实际和分辨光谱。(a)激发光谱图; (b)发射光谱图
Fig. 4. Actual and resolution spectra of BLLS/RBL. (a) Excitation spectra; (b) emission spectra
4.3 抗生素混合溶液的定量分析
将预测集样本依次输入进PARAFAC和BLLS/RBL两种模型中,进行混合溶液中各组分的定量预测,并结合定量结果的品质指数,比较两种方法的预测结果,如
表 2. 浓度预测结果
Table 2. Concentration prediction results
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5 结论
针对水溶液中喹诺酮类抗生素混合组分在定性分析中出现的光谱混叠问题,采用二阶校正算法完成对抗生素混合水溶液的定性、定量分析,用“数学分离”的思想取代“化学分离”,简化了分析过程,分离得到的各组分抗生素与原始单组分物质的光谱吻合度极高,相较于PARAFAC算法,BLLS/RBL算法的灵敏度更高,均方根误差更小,检出限更低,回收率更接近100%,因此三维荧光光谱技术结合BLLS/RBL算法是一种有效的水中抗生素检测手段。
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