荧光寿命显微成像（FLIM）已经广泛应用于生命科学研究领域，具有高灵敏和高特异性的特点，在对组织微环境进行定量表征方面具有独特优势，但由于成像速度相对较慢，限制了FLIM的活体应用。近年来，随着光电子器件和人工智能等技术的发展，开启了FLIM活体成像新篇章。介绍通过优化硬件和算法两方面提升时域和频域FLIM技术的成像速度，以及其在生物医学基础研究和临床疾病诊断中的应用研究进展。最后，对活体FLIM成像的未来发展进行展望。

高时空分辨可视化技术是脑科学研究的重要工具。荧光显微成像技术在特异性、多样性、图像对比度和时空分辨率等方面具有显著优势，但由于光在组织中的穿透深度有限，无创的荧光成像难以在活体水平获取深层脑区神经血管单元的高分辨结构和功能信息。因此，在脑科学研究中，荧光内窥显微成像技术受到越来越多研究者的青睐。得益于相关科学技术的发展，内窥镜探头在保持高性能的同时，实现了小型化并提供了更大的灵活性，可以植入活体大脑的不同深度处，开展特定深层脑区的功能调控研究。本综述介绍了基于梯度折射率透镜和单根多模光纤这两种探头的植入式荧光内窥显微成像技术及其发展和迭代进程，概述了它们在高分辨活体脑成像研究中的应用，以及在临床神经外科手术中的初步探索性应用。最后，展望了荧光内窥脑成像技术未来的发展前景。

为进一步提高双光子多焦点结构光照明显微技术（2P-MSIM）的空间分辨率，笔者提出并发展了一种双光子亚衍射多焦点结构光照明显微成像方法（2P-sMSIM）。首先，通过改进的Gerchberg-Saxton（GS）相位恢复算法设计亚衍射聚焦点阵，生成相位图，利用高速相位型空间光调制器产生亚衍射聚焦点阵。通过计算机模拟的仿真实验，探究算法的可行性，并通过对荧光染料溶液的激发成像，证明了每个亚衍射聚焦点阵的平均尺寸为正常衍射受限点阵聚焦点尺寸的80%。其次，将该点阵引入2P-MSIM系统，对固定在BS-C-1细胞内的微管和商用线粒体切片分别进行了超分辨成像实验，证明了在亚衍射聚焦点阵激发下，2P-MSIM的分辨率和成像质量得到了进一步提高，这对于2P-MSIM的发展具有重要意义。

为了进一步提高成像速度和分辨率，提出了基于双螺旋点扩展函数（DH-PSF）工程的多焦点双光子激光扫描显微成像方法和系统（DH-MTPLSM）。在激发光路中，通过高速相位型空间光调制器（SLM）同时实现了三维多焦点阵列的产生和在样品面上的高精度并行数字寻址扫描；在探测光路中，通过双螺旋相位片将系统探测PSF调制为DH-PSF，从而提供样品的轴向信息，减少轴向扫描层数，进而提高三维成像速度；结合基于DH-PSF的数字重聚焦算法，恢复出不同深度样本的宽场图像，通过单次二维扫描获得样品的三维光切片信息。在此基础上，利用搭建的DH-MTPLSM系统开展了小鼠肾组织切片的双光子成像实验，验证了该方法的快速三维高分辨成像能力，这对于MTPLSM的发展具有重要的意义。