显微三维数字图像相关系统中体视显微镜景深小,光路复杂,宏观标定方法不适用于该系统。针对此问题,提出一种适用于显微立体视觉的定点旋转标定方法。基于体视显微镜放大倍率与景深的关系,建立数学模型,得到标定板与XY平面间的最大夹角,设计定点旋转平台对标定板进行旋转标定,通过系列实验对标定参数进行优化,得出使标定参数整体误差最小的夹角。标定结果表明,主点坐标误差不超过1.8 pixel,Z分量相对平移向量的最大偏差值小于0.15 mm,姿态数为10或10以上时标定结果趋于稳定。借助于精密位移台对标定结果进行了精度验证,结果表明采用所提方法标定后位移测量的平均相对误差为2.2%,平均均方差为0.36 μm。