1 引言

血液的主要功能之一是输送营养物质,其流动速度与机体的新陈代谢、心率以及不同器官类型密切相关。当人体出现疾病或组织循环障碍时,血液的正常流动或组织灌注就会发生变化,因此通过监测血液流速的变化可以探查组织器官的病变及受伤害等情况,这对血管痉挛、贫血等疾病的治疗和病理研究具有重要意义^[1-2]。

目前,测量血液流速的方法主要有多普勒光学相干层析成像(DOCT)^[3]、超声成像(US)^[4]、激光散斑成像(LSI)^[5]、扩散相关谱(DCS)^[6]、正电子发射型计算机断层成像(PET)^[7]、核磁共振(MRI)^[8]、计算机断层扫描(CT)^[9]等。DOCT通过多普勒效应来测量血液流速,主要方式有相位解析DOCT^[10]、多普勒微血管造影^[11]等,但只能测量出血液沿入射光束传播方向的运动速度,若要计算血液的绝对运动速度则需要预先知道多普勒角^[12]。有研究者在DOCT中利用多光束探测多普勒频移,该方法虽然可以在多普勒角未知的情况下测量血液的绝对流速,但实验装置复杂,需要调整硬件,并进行光学对准^[13-14]。US常用于无损伤的血流测量,但该方法易受杂波的影响,分辨率较低^[15]。LSI利用样品的漫反射光随时间的变化来测量血液流速,可实时成像,但仅限于对样品的浅表层成像^[16]。DCS拥有高的空间分辨率和较好的成像深度,但需要考虑光学探头对样品的压迫作用^[17]。PET是研究脑血液动力学的标准技术之一,需要注入放射性示踪剂^[18]。MRI设备昂贵。CT依赖于电离辐射,对人体有一定的伤害。

光声显微成像(PAM)是一种基于探测激光诱导超声波的成像方法,具有高光学对比度、高分辨率等优点^[19]。近年来,利用光声效应对血液流速进行测量的研究受到了广泛关注,主要有多普勒法^[20]、密度追踪法^[21]、渡越时间法^[22]、振幅编码法^[23]等。光声相关谱法(PACS)是渡越时间法中的一种,它通过分析光声信号幅度的变化来测量血管中血液的流速^[24]。由于激光重复频率和采集卡的数据采集速率有限,目前的PACS能够测量的最大血液流速为21 mm/s^[25]。人体内不同血管中的血液流速不同,如毛细血管中血液的平均流速约为1 mm/s,而小动脉中血液的平均流速约为50 mm/s^[26]。若利用PACS监测人体小动脉中血液流速的变化情况,则需要扩大PACS能够测量的血液流速范围。同时,目前的PACS方法没有考虑血液流动方向与入射激光传播方向的夹角对血液流速测量的影响,这会给血液流速的测量带来误差。

本文利用PACS测量了模拟血管样品中去纤维新生牛血的流速。通过提高激光的重复频率,增大了PACS能够测量的血液流速的范围,分析了重复频率对血液流速测量的影响;此外,还分析了利用PACS方法测量血液流速过程中,血液流动方向与入射激光传播方向之间的夹角对血液流速测量的影响。

2 原理

PACS类似于荧光相关谱(FCS)技术,当血红细胞穿越激光照射区域时,血红细胞吸收脉冲激光的能量,并产生光声信号。利用超声换能器采集光声信号,可以得到光声信号强度P(t)随时间的变化^[27],可表示为

P(t)≡∫I(r)n(r,t)d3r,(1)

式中:I(r)为激光光束的归一化空间能量分布;n(r,t)为t时刻在位置r处的粒子浓度。类似于FCS中荧光强度的变化,P(t)可以提供流动粒子发出的光声信号强度随时间的变化情况,通过P(t)的归一化自相关函数G(τ)可以计算出血红细胞渡越激光照射区域的时间^[24]。G(τ)的表达式为

G(τ)=<δP(t)δP(t+τ)>/<P(t)>2,(2)

式中:τ为滞后时间;δP(t)=P(t)-<P(t)>,符号<>表示求平均。

聚焦的探测光束强度在垂直于传播方向上(x-y面内)呈高斯分布,其光强可表示为

I(x,y,z)=I0exp(-2x2/r02-2y2/r02-2z2/z02),(3)

式中:I₀为激光峰值强度;x、y为探测光束的径向位置;z为探测光束的轴向位置;r₀和z₀分别为探测光束的径向半径和瑞利长度。在呈高斯分布的聚焦光束的照射下,归一化自相关函数G(τ)可以表示为

G(τ)=1N×11+τ/τd11+(r0/z0)2τ/τd×exp-ττf2×11+τ/τd,(4)

式中:N=1/G(0),G(0)的大小与探测光束照射区域内的粒子浓度有关;τ_f为血红细胞渡越一半探测光束照射区域所用的时间;τ_d= r02/(8κ),其中κ为扩散系数。当血红细胞在血管中传输时,κ值很小,故G(τ)又可以表示为

G(τ)=1/N×exp[-(τ/τf)2]。(5)

利用(5)式对P(t)的归一化自相关数据进行拟合,就可以得到τ_f。当r₀已知时,血红细胞在探测光束照射区域内的流速为

vf=r0/τf。(6)

图 1. 血管穿过探测光束照射区域示意图

Fig. 1. Schematic of vessel passing through the probe beam region

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图1所示为血管穿过探测光束照射区域的示意图,其中探测光束的束腰直径为R,血管在探测光束照射区域内的长度为L,故PACS测得的血液流速可表示为

vmeasured=RT=RL/vorigin=vorigin·RL=vorigin·cosθ,(7)

式中:T为血红细胞穿过探测光束照射区域的实际时间;v_origin为实际的血液流速;θ为血流方向与垂直于入射激光传播方向之间的夹角。由(7)式可知,

PACS测得的结果是垂直于入射激光传播方向的血液流速。

3 实验与分析

对血液流速进行测量的光声实验系统示意图如图2所示。系统中光源发出的激光照射到中性密度(ND)滤光片上,其中的透射光通过显微物镜L1耦合进单模光纤(SMF),而反射光被光电探测器(PD)接收,作为信号采集系统的触发信号。通过SMF的激光先经透镜L2准直,然后通过振镜后被透镜L3聚焦在流体样品上。流体样品由恒流泵注入至微管中,样品被激光照射后产生光声信号,信号被超声换能器接收。接收到的信号经过滤波、放大后由高速数据采集卡采集,最后由计算机进行后续数据处理。实验中采用计算机控制激光的发射和光声信号的同步采集。

图 2. 测量血液流速的光声实验系统示意图

Fig. 2. Schematic of the experimental system for measuring velocity of blood flow

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图 3. 基于PACS方法的血液流速测量结果。(a)模拟血管中血液的图像;(b)归一化的P(t)信号;(c) P(t)自相关数据及拟合曲线

Fig. 3. Blood flow velocity measured by PACS method. (a) Photoacoustic image of blood flow phantom; (b) normalized P(t) signal; (c) calculated and fitted autocorrelation curves of P(t)

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图 4. 在重复频率为2 kHz及不同血液流速下测得的P(t)的自相关数据及拟合曲线。(a) 1 mm/s;(b) 2 mm/s;(c) 3 mm/s;(d) 4 mm/s;(e) 5 mm/s;(f) 6 mm/s

Fig. 4. Calculated autocorrelation data and fitted curves at repetition frequency of 2 kHz and different velocities of blood flow. (a) 1 mm/s; (b) 2 mm/s; (c) 3 mm/s; (d) 4 mm/s; (e) 5 mm/s; (f) 6 mm/s

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图 5. 在2 mm/s血液流速及不同激光重复频率下测得的P(t)的自相关数据及拟合曲线。(a) 0.5 kHz;(b) 1 kHz;(c) 2 kHz;(d) 3 kHz;(e) 4 kHz;(f) 5 kHz

Fig. 5. Calculated autocorrelation data and fitted autocorrelation curves at velocity of blood flow of 2 mm/s and different laser repetition frequencies. (a) 0.5 kHz; (b) 1 kHz; (c) 2 kHz; (d) 3 kHz; (e) 4 kHz; (f) 5 kHz

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系统光源为意大利Bright Solutions公司生产的Wedge HF 532脉冲激光器,激光波长为532 nm,最大Q开关重复频率为100 KHz;透镜L2和透镜L3的焦距均为30 mm。微管为石英玻璃管,其内径为200 μm,外径为300 μm。注射泵为中国兰格实验室生产的LSP01-1A微量注射泵,其最小线速度为5 μm/min,行程控制误差不大于±0.5%。利用容量为1 mL、内径为4.6 mm的注射器将血液样品注入微管中。所用超声换能器的中心频率为35 MHz,3 dB带宽为20 MHz;滤波器为高通滤波器,截止频率为20 MHz;信号采集设备为美国Gage公司生产的Gage CSE 1622数据采集卡,采样率为100 MSa/s。血液样品为去纤维新生牛血。

3.1 激光重复频率对血液流速测量的影响

利用PACS对已知流速的血液样品进行测量。探测光束垂直向下入射,模拟血管样品放置在一个水槽中,血液流动方向与探测光束传播方向垂直。在激光重复频率为10 kHz、血液流速为2 mm/s的条件下,测量结果如图3所示。图3(a)所示为模拟血管中血液的光声图像,取模拟血管的一个横截面,并测量其中心点(红十字)位置处的血液流速。在获得连续的光声A-line信号后,选取A-line信号强度的峰峰值作为P(t)。图3(b)所示为归一化后的P(t)信号;图3(c)所示为P(t)信号的自相关计算结果(离散点)。利用(5)式进行拟合,结果如红色曲线所示,拟合的决定系数R²为0.982,血红细胞渡越一半探测光束区域的时间为2.692 ms。

在设定重复频率为2 kHz不变的条件下,利用PACS方法分别对设定流速为1,2,3,4,5,6 mm/s的血液的流速进行测量。图4所示为测量的自相关数据、拟合曲线、拟合的决定系数以及血红细胞的渡越时间τ_f。对于一次准确的拟合测量,拟合的决定系数应不小于0.9。当设定流速为1,2,3,4 mm/s时,拟合的决定系数分别为0.967、0.926、0.914、0.90,τ_f分别为5.16,2.43,1.8,1.33 ms。当设定流速为5 mm/s和6 mm/s时,拟合的决定系数分别为0.879和0.845,小于0.9;τ_f分别为1.34 ms和1.21 ms,未随着流速增大而相应地减小。当激光重复频率不变、血液流速增大时,系统采集到的有效数据减少;当血液流速过大时,τ_f的拟合就会出现误差。

在设定血液流速为2 mm/s不变的条件下,当激光重复频率分别为0.5,1,2,3,4,5 kHz时,利用PACS方法对血液流速进行测量。图5所示为测量结果和相应的拟合曲线、决定系数以及渡越时间τ_f。对于相同的血液流速,τ_f拟合出的结果应该一致。当激光重复频率分别为1,2,3,4,5 kHz时,拟合的决定系数分别为0.91、0.926、0.949、0.942、0.973,均大于0.9,τ_f分别为2.49,2.43,2.58,2.37,2.48 ms。但是当激光重复频率为0.5 kHz时,采集到的有效数据非常少,虽然数据拟合的决定系数为0.95,但τ_f为5.2 ms,与其他重复频率下测量的结果相比有很大误差。当血液的流速不变、激光重复频率过小时,系统采集到的有效数据有限,这会给τ_f的拟合带来误差。

图 6. (a)渡越时间随设定流速的变化及(b)测量流速与实际流速

Fig. 6. (a) Dependence of the flow time on the designed velocity and (b) the measured velocities versus the actual velocities

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实验结果表明,在利用PACS方法测量血液流速时,需要采集足够多的有效数据来确保数据拟合的准确性。血液流速越快,所需要的激光重复频率越高。当需要测量小动脉中的血液流速时,激光重复频率应大于10 kHz。对于实验系统中的脉冲激光光源,当重复频率大于10 kHz时,单脉冲激光束的能量随重复频率的增大而减小,无法产生信噪比较高的光声信号。因此,当激光的重复频率大于10 kHz时,为了产生具有较高信噪比的光声信号,需要增大激光器的输出能量。当激光器工作在其最高重复频率100 kHz时,通过增大输出能量也能产生信噪比较高的光声信号。

3.2 血液流速计算

为了计算血液流速,需要获得不同已知流速的自相关数据,并由此校准探测区域激光光束的有效半径。图6(a)所示为血红细胞渡越时间τ_f随设定血液流速的变化。利用方程τ_f=r₀/v_f对图6(a)中的数据进行拟合,得到探测光束半径为5.08 μm,拟合的决定系数为0.997。利用校准后的激光光束有效半径r₀可以对不同的血液流速进行测量。图6(b)中分别用散点和实线给出了利用PACS法测量出的流速以及对应的实际流速。散点与实线数据的相关系数为0.992,说明测量的血液流速与实际血液流速具有较好的一致性。

通过改变激光的重复频率可以评估系统利用PACS方法测量血液流速的有效范围。当激光重复频率为100 kHz时,系统所能测量的最短的血红细胞渡越时间为0.055 ms,根据方程v_f=r₀/τ_f可以计算出系统所能测量的最大血液流速为92.3 mm/s。此外,由于微流泵最小注入速度的限制,系统所能测量的最大渡越时间为86.1 ms,即系统所能测量的最低血液流速为0.059 mm/s。

3.3 样品倾斜角度对血液流速测量的影响

为了提高血液流速测量的准确性,验证血流方向与入射激光传播方向的夹角对血液流速测量的影响。将血流方向与垂直于入射激光传播方向的夹角定义为样品倾斜角度,针对同一流速的血液样品,在-75°~75°的倾斜角度范围内,每隔15°测量一次血液流速,测量结果如图7所示。可以看出:当倾斜角度为0°时,测得的血液流速即为实际的血液流速;当样品倾斜角度发生变化时,测量的血液流速与实际血液流速的比值与倾斜角度呈余弦关系,即PACS方法测量出的血液流速是实际血液流动的横向速度分量。由于入射激光方向已知,当转动样品到特定位置测得样品的流速最大时,即可获得样品的倾斜角度信息。

图 7. 不同倾斜角度下测量血液流速与实际血液流速的比值

Fig. 7. Ratio between the measured flow velocity and the actual flow velocity at different tilt angles

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4 结论

研究了激光重复频率和样品倾斜角度对基于PACS方法测量血液流速结果的影响。结果表明:血液流速越快,所需要的激光重复频率越高。通过调节激光重复频率和激光输出能量,得到系统可以测量的血液流速范围为0.059~92.3 mm/s,测得的血液流速与实际血液流速的相关系数为0.992。测得的血液流速与实际血液流速的比值与样品倾斜角度呈余弦关系,说明PACS方法更适用于测量垂直于入射激光传播方向的血液流速。该研究有望应用于生物组织中绝对血流速度的测量。