1 引言

表面等离子体共振(SPR)传感器是一种常用于生物大分子探测与分析的消逝波传感器^[1],具有灵敏度高、实时性好、无需荧光标记等优点^[2-7]。常规SPR传感器采用50 nm厚的致密金膜作为敏感层,对小分子靶标的灵敏度较低,不适合直接探测分子量小于200 Da的小分子^[8-9]。为了提高SPR传感器对小分子的灵敏度,通常会在致密金膜表面覆盖一层纳米多孔介质薄膜,如TiO₂、SiO₂、Al₂O₃等^[10-12]。这些纳米多孔介质薄膜不仅具有富集小分子靶标的能力,还能将消逝场与靶标分子的作用深度从单分子层厚度扩展至整个多孔介质薄膜的厚度,从而达到显著提高SPR传感器对小分子的探测灵敏度的目的^[13]。但是,纳米多孔介质薄膜的制作工艺较为复杂,使得传感器制作成本增加。因此,有必要研究制作工艺简单的SPR传感器,用于小分子靶标的高灵敏探测。本文利用射频溅射-化学脱合金两步法成功制作出结构简单的纳米多孔金薄膜(NPGF)SPR传感器。

NPGF热力学和化学稳定性好,比表面积大,孔隙率高,对小分子的吸附能力强,适宜用作分子富集层;NPGF的孔径通常为数纳米至数十纳米,远小于可见-近红外波段的波长,因此是光学均匀薄膜,其表面可激发SPR表面电磁波^[14-15],能够用于制备SPR生化传感器。NPGF的另一优点是能够利用成熟的硫-金键化学方法对其内外表面进行改性,按照不同的用途,使其成为亲水膜、疏水膜、选择性分子富集膜等^[16-18]。NPGF的这些优点为其作为SPR传感器赋予了巨大的应用前景。

本文利用射频溅射-化学脱合金两步法制作出附着力强、大面积均匀的NPGF。利用自建的宽光谱SPR检测平台测试了NPGF在可见-近红外波段的共振光谱,实验研究了NPGF-SPR传感器对水溶液中的Pb²⁺离子和三聚氰胺的响应特性。

2 实验部分

2.1 试剂与仪器

硝酸铅[Pb(NO₃)₂,分析纯]、三聚氰胺(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司,用于配制待测样品溶液;硝酸(HNO₃,分析纯)用于化学脱合金过程中腐蚀掉金银合金薄膜中的银组分。实验用去离子水由Milli-Q纯净水机制备。

厚度为1 mm的玻璃基片购自日本Matsunami株式会社;45°/45°/90°玻璃棱镜购自北京北东光电自动化开发公司,在633 nm波长条件下折射率为1.799;LS-1卤钨灯购自美国Ocean Optics公司;HR4000型电荷耦合器件(CCD)光谱分析仪购自美国Ocean Optics公司;多模石英光纤购自浙江雷畴科技有限公司;透镜和线性偏振片购自北京大恒光电技术公司;硅橡胶样品测试槽购自南京永润橡塑有限公司;蠕动泵购自保定兰格恒流泵有限公司。

2.2 NPGF薄膜的制备

采用射频溅射和化学脱合金相结合的两步法制备了NPGF-SPR传感芯片。首先,通过射频溅射镀膜技术在干净的玻璃基底表面依次溅射3 nm铬膜、10 nm金膜和60 nm的金银合金薄膜。然后将玻璃基底浸入适量浓硝酸中在室温下(约20 ℃)腐蚀4 min,将金银合金薄膜中的银原子充分溶解,留在玻璃基底上的金原子发生重构,形成孔-孔互通的三维无序多孔结构。此时,金银合金膜的颜色将由从最初的银白色变为棕褐色,该颜色变化主要来自于金属纳米结构所特有的局域表面等离子体共振效应(LSPR),意味着薄膜中多孔结构的形成。NPGF孔内残留的硝酸可使其孔隙进一步粗化,因此待腐蚀完全后需迅速地将玻璃基底取出并用足量的去离子水反复浸泡、冲洗,以彻底去除残留的硝酸。最后,用氮气将NPGF表面吹干,即为实验用NPGF-SPR传感芯片。

2.3 实验装置

图1(a)展示了基于Kretschmann结构的波长检测型SPR传感装置示意图。如图1所示,将制备好的NPGF-SPR传感芯片固定在棱镜和样品槽之间,使得玻璃基底的背面通过高折射率耦合液与棱镜底面紧密贴合而NPGF暴露在样品槽内部,样品槽中的待测溶液由蠕动泵泵入和泵出。卤钨灯发出的宽带光经多模石英光纤、聚焦透镜及线性偏振片变为横磁(TM)偏振的准平行光束(发散角小于0.2°)。该光束以图1(a)所示的入射角θ射入棱镜,并在玻璃基片/NPGF界面发生全反射 (对应全反射角φ),全反射产生的消逝场穿透NPGF并与NPGF/空气界面发生作用。当在棱镜中入射光的波矢的横向分量与在NPGF/空气界面传播的表面等离子体波的波矢相匹配时,就会激发SPR,导致从棱镜中射出的反射光光谱出现一波谷,谷底位置即为SPR共振波长。NPGF既容许激励传播型表面等离子体共振效应(PSPR),又能产生LSPR,本实验重点研究PSPR。

图 1. (a)基于Kretschmann结构的波长检测型SPR传感装置示意图;(b) NPGF/空气界面上的PSPR效应示意图

Fig. 1. (a) Schematic diagram of the wavelength-interrogated SPR sensing device based on Kretschmann structure; (b) schematic diagram of the PSPR on the NPGF/air interface

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图1(b)是约束于NPGF/空气界面上的PSPR模式示意图。从图中可知,在NPGF-SPR传感芯片表面产生的消逝场可穿透整个NPGF的厚度,因此能够在整个厚度内与富集在多孔层内的靶标分子相互作用,从而提高传感器的灵敏度。这里需要指出的是当入射角θ位于棱镜斜面的法线与棱镜底面之间的区间时,θ>0;反之,θ<0。

3 结果与讨论

3.1 NPGF孔隙率的确定

图2(a)是实验制备的NPGF的扫描电子显微镜(SEM)照片,薄膜呈现分布均匀的三维无序孔状结构。这种多孔结构十分有利于小分子的快速扩散和吸附。对于NPGF-SPR传感器而言,孔隙率作为传感芯片的重要参数,直接影响传感器的检测灵敏度。为了进行比较,采用两种方法对NPGF的孔隙率进行确定。

图 2. (a) NPGF的SEM照片;(b) SEM照片经Image J软件自动阈值处理后得到的黑白图像

Fig. 2. (a) SEM image of the NPGF; (b) black-white image obtained after automatical threshold processing of the SEM image with the Image J software

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第一种方法是采用Image J软件对SEM照片进行后期处理,图像处理算法的第一步是对SEM灰度图像进行阈值处理,将其转换为黑白图像。在进行图像处理时采用自动阈值以达到与原始图片一致的效果。图2(b)是通过Image J软件在自动阈值条件下分析得到的图像,图中黑色部分为孔,白色部分为金骨架。利用这种方法得到的NPGF的孔隙率约为0.343。

第二种方法首先利用自制的波长检测型SPR平台测量NPGF在给定入射角下的共振光谱,确定其共振波长。然后通过利用菲涅耳公式结合Bruggeman介电常数近似方程拟合实验获得的共振光谱,进而得到NPGF的孔隙率。由图2(a)可知,NPGF的孔径远小于可见-近红外波段的波长,故是光学均匀薄膜,其平均复折射率(n=n'+in″)可通过Bruggeman介电常数近似方程求解得出^[19]:

f1n12-n2n12+2n2+f2n22-n2n22+2n2+f3n32-n2n32+2n2=0,(1)

式中f₁、f₂、f₃依次为NPGF中金、孔及孔内吸附物的体积分数,且f₁+f₂+f₃=1;n₁、n₂、n₃分别为以上三种物质的折射率;f₂+f₃即为NPGF的孔隙率。假设NPGF未吸附任何外来分子,即f₃=0,此时f₂即为孔隙率。将f₂作为拟合参数,利用(1)式建立平均复折射率与孔隙率的函数关系式,然后将该关系式代入菲涅耳公式进行计算,使得计算得到的共振波长与实验测得的共振波长一致,此时对应的f₂的值即为NPGF的孔隙率。图3(a)显示了采用波长检测型SPR传感平台实验测得在入射角分别为θ=-13°和θ=-12°时NPGF在空气中的共振光谱。可以看到每一条光谱曲线都包含一个明显的凹槽,这归功于PSPR的吸收,说明NPGF在这两个入射角下都能够产生有效的SPR效应。图3(b)为利用菲涅耳公式结合Bruggeman介电常数近似方程,在f₂=0.38时仿真得到的对应入射角下的共振光谱,其与实验测得的共振波长基本一致,说明实验制备的NPGF的孔隙率约为0.38。

图 3. (a)实验测得的NPGF在空气中的SPR光谱;(b)利用菲涅耳公式结合Bruggeman介电常数近似方程仿真得到的SPR光谱

Fig. 3. (a) SPR spectra of the NPGF in the air measured by the experiment; (b) simulated SPR spectra using the combination of the Fresnel formula and the Bruggeman dielectric constant approximation equation

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由两种方法获得的NPGF的孔隙率近似相等。与第二种方法给出的孔隙率相比,由第一种方法得到的孔隙率稍微偏小,可能原因是SEM图像无法观测到那些非表面开口的孔。

3.2 NPGF-SPR传感器对重金属Pb2+的敏感特性研究

本实验利用硝酸铅溶于去离子水中配制了0~1000 nmol·L^-1一系列不同浓度的Pb²⁺样品溶液。首先测试NPGF在入射角θ=-12°时的共振光谱,如图4(a)中的黑线所示,此时的共振波长λ_R=704.98 nm。之后将10 mL浓度为1 nmol·L^-1的Pb²⁺样品溶液泵入样品槽中,静置吸附达到平衡后,通过蠕动泵将溶液完全泵出,并对NPGF进行干燥处理以彻底去除被吸附的水分子。再次记录反射光谱,发现共振波长红移至706.31 nm,此时共振波长变化量Δλ_R=1.33 nm。结果稍大于实验采用的电荷耦合器件(CCD)光谱仪的分辨率0.50 nm,故认为传感器对重金属Pb²⁺的探测下限约为1 nmol·L^-1。依此方法,按照从低浓度到高浓度的顺序依次测试其他样品溶液。图4(a)为NPGF吸附不同浓度的重金属Pb²⁺溶液后的SPR共振光谱响应。从图中可以看出,随着溶液浓度的增加,共振光谱逐渐向长波方向移动,这表明在NPGF孔内富集的重金属Pb²⁺的数量在不断增加。当重金属Pb²⁺溶液的浓度 CPb2+=1000 nmol·L^-1时,共振波长变化量总计为Δλ_R=11.98 nm。图4(b)为Δλ_R与 CPb2+的关系及拟合曲线,其拟合方程为Δλ_R=3.38 lg CPb2++1.94 (R²=0.988)。结果说明Δλ_R与 CPb2+成正相关,传感器对重金属Pb²⁺具有良好的响应。

图 4. (a) θ=-12°时,NPGF-SPR传感器从不同浓度水溶液中吸附Pb2+离子后产生的光谱响应;(b) 共振波长变化量与Pb2+浓度的依赖关系

Fig. 4. (a) Spectral responses of the NPGF-SPR sensor to Pb2+ ions adsorbed from aqueous solutions of different concentrations when θ=-12°; (b) resonant-wavelength shifts as a function of the Pb2+ concentration

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为进一步对比NPGF-SPR传感器的灵敏度,采用离位探测的方法测试了基于致密金膜的SPR传感器对水溶液中重金属Pb²⁺的吸附响应。图5所示为致密金膜浸泡吸附500 nmol·L^-1重金属Pb²⁺溶液前后的SPR共振谱,对应的共振波长变化量为Δλ_R=4.01 nm。而NPGF在浸泡吸附10 nmol·L^-1重金属Pb²⁺溶液后产生的共振波长变化量为Δλ_R=4.43 nm。由此可知,在等共振波长变化量的条件下,NPGF-SPR传感器的灵敏度较高,是致密金膜SPR传感器的50倍。

图 5. θ=-18°时,致密金膜SPR传感器浓度为500 nmol·L-1的水溶液中吸附Pb2+离子后产生的光谱响应

Fig. 5. Spectral response of the dense gold film based SPR sensor to Pb2+ ions adsorbed from an aqueous solution of 500 nmol·L-1 concentration when θ=-18°

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基于NPGF的SPR传感器对重金属Pb²⁺的高灵敏度主要有以下三个原因:1)NPGF的大比表面积提供了大量的分子结合位点,使其可以在多孔层内富集更多的目标分子;2)消逝场与目标分子的作用深度从单分子层扩展至整个NPGF的厚度;3)NPGF表面可同时激发PSPR与LSPR,而且LSPR使其表面的电磁场增强,并与表面等离子体波发生耦合作用,使共振波长产生的变化量增大,进一步提高了传感器的灵敏度。此外,重金属Pb²⁺是溶于水的,因此待样品溶液吸附达到平衡后泵出时,会将仅仅通过较弱的物理吸附作用于致密金膜表面上的部分重金属Pb²⁺顺势带出。相比之下,富集在NPGF多孔层内的重金属Pb²⁺受到三维结构的层层保护,导致其不易被样品溶液带出。故NPGF-SPR传感器对重金属Pb²⁺的灵敏度比常规SPR传感器高很多。

3.3 NPGF-SPR传感器对三聚氰胺的敏感特性研究

本实验采用去离子水配制了1~150 nmol·L^-1不同浓度的三聚氰胺待测样品溶液。图6(a)为NPGF-SPR传感器浸泡吸附不同浓度的三聚氰胺溶液后暴露在空气中时产生的共振光谱。由图可知,随着浓度的增加,共振光谱逐渐红移。NPGF在空气中的初始共振波长为707.20 nm。当三聚氰胺溶液的浓度为1 nmol·L^-1时,对应的共振波长变化量为0.90 nm,即探测下限为1 nmol·L^-1。图6(b)为共振波长变化量Δλ_R与三聚氰胺溶液浓度C之间的曲线关系,其拟合方程为Δλ_R=7.17ln(C+39.52)-24.74(R²=0.974)。

图 6. (a) θ=-12°时,NPGF-SPR传感器从不同浓度水溶液中吸附三聚氰胺分子后产生的光谱响应;(b)共振波长变化量与三聚氰胺浓度的依赖关系

Fig. 6. (a) Spectral responses of the NPGF-SPR sensor to melamine molecules adsorbed from aqueous solutions with different concentrations when θ=-12°; (b) resonant-wavelength shifts as a function of the melamine concentration

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4 结论

通过射频溅射和化学脱合金组成的两步法制备了NPGF-SPR传感芯片,采用波长检测型SPR平台观测到了NPGF在空气中的共振吸收峰。通过利用菲涅耳公式结合Bruggeman介电常数近似方程拟合测得的共振吸收峰,获得了NPGF的孔隙率约为0.38,非常接近从SEM图像处理得到的孔隙率。NPGF优秀的分子富集功能和显著的SPR效应,使得NPGF-SPR传感器适用于生化小分子的痕量探测。实验结果表明未经表面修饰的NPGF能够非特异性富集水溶液中的Pb²⁺和三聚氰胺,使得NPGF-SPR传感器对它们的探测下限均达到1 nmol·L^-1,而且对比实验表明这种NPGF-SPR传感器的灵敏度远高于常规的致密金膜SPR传感器。考虑到NPGF很容易通过成熟的硫-金表面化学处理方法实现特异性分子富集功能,这种结构简单的NPGF-SPR传感器在特异性生化检测方面也具有重要的应用价值。