法莫替丁与牛血清蛋白相互作用的光谱研究 
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1 引言
蛋白质是人体内最重要的组成部分,不仅能为人体提供能量,还是生命活动的主要承担者。蛋白质的结构组成是生物科学领域的核心课题之一,人们尝试采用不同的分析方法来解析药物对蛋白质结构功能的影响[1-2]。血清蛋白是蛋白质的一种,能起到结合并搬运许多内源和外源化合物,并将其送至目标部位的重要作用[3-6]。研究血清蛋白与药物小分子的相互作用有助于理解药物传输、分配、生效的机理,也有助于新药的研发[7-9]。
牛血清蛋白(BSA)结构稳定,价格低廉,与人血清蛋白(HSA)同源,因此常被用作HSA的替代品,研究药物在人体内的运作[10]。
组胺H2受体的发现推动了抑制胃酸和胃液分泌的抗消化道溃疡类药物的研制,西咪替丁、雷尼替丁和法莫替丁等新药都是是受体研究的重要成果[11]。法莫替丁能有效抑制胃酸分泌,可用来治疗胃及十二指肠溃疡、急性胃黏膜出血,以及反流性食道炎等[12-13]。本文结合荧光光谱和紫外吸收光谱研究了法莫替丁与BSA之间的作用类型和作用力,为厘清法莫替丁在人体内的生效机理提供了依据。
2 实验部分
2.1 试剂与仪器
BSA购于南京奥多福尼生物科技有限公司,其纯度大于80%,分子相对质量为66430。称取适量BSA并用含0.05 mol/L NaCl的0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液配制成BSA溶液,备用。实验用水为蒸馏水。
法莫替丁购于上海信谊药厂有限公司,其分子式为C8H15N7O2S3,分子相对质量为337.45。分子结构式如
实验采用的仪器有Perkins Elmer LS55荧光分光光度计、上海天美UV3600紫外可见分光光度计、上海江星HH-2数显恒温水浴锅、上海舜宇恒平FA2004电子天平(精度为0.0001)、德国Eppendorf公司微量移液枪(10 μL,100 μL,1000 μL)。
2.2 实验方法
用移液枪取3 mL 5.3×10-7 mol/L的BSA溶液转移到比色皿中,将比色皿水浴加热至32 ℃,然后放入荧光光谱仪中进行扫描;采用波长为285 nm的激发光,激发和发射狭缝宽度为4 nm,扫描速度为300 nm/min。先测量未加药时纯BSA的光谱,接着逐次加入5 μL 2.96×10-6 mol/L的法莫替丁溶液,并逐一测量其光谱。再将水浴锅温度调节至40 ℃,重复以上操作。
为计算结合距离,取5×10-6 mol/L的BSA溶液和法莫替丁溶液,用上海天美UV3600紫外分光光度计测量其在290~450 nm波长范围内的紫外吸收光谱;将LS55荧光光谱仪激发波长设定为285 nm,设定激发和发射狭缝为5 nm,扫描BSA溶液在290~450 nm波长范围内的荧光光谱。
3 结果与讨论
3.1 荧光猝灭光谱
广义上来说,能令荧光强度或相关峰位发生变动的作用过程都可以称为荧光猝灭。荧光猝灭剂是能与荧光物质分子发生相互作用,令荧光强度和相关激发峰位、荧光峰位发生变化的物质[14]。
3.2 荧光猝灭类型
蛋白质和小分子相互作用的猝灭类型通常分为两类:静态猝灭和动态猝灭[15]。静态猝灭是指荧光分子和猝灭分子在基态通过络合反应生成超分子化合物,从而使荧光基团的发光强度减弱;动态猝灭是指荧光物质的激发态分子与猝灭分子发生碰撞,经电荷或能量转移后返回到基态的过程。
辨别猝灭类型的方法通常是根据温度改变前后猝灭常数的变化趋势。温度上升后,如果发生的是动态猝灭,那么粒子的碰撞将会被加剧,猝灭常数增大;相反,若是静态猝灭,结合物的稳定性会随着温度升高而降低,猝灭常数会降低。因此,猝灭机理可以用温度的变化来辨别[16-20]。
猝灭机制可以由Stern-Volmer方程来描述:
式中
通过分析
图 3. 法莫替丁与BSA相互作用的Stern-Volmer曲线
Fig. 3. Stern-Volmer plots of BSA interacted by famotidine
表 1. 法莫替丁-BSA体系的Stern-Volmer方程、猝灭常数及速率常数
Table 1. Stern-Volmer equation, quenching constant and quenching rate constant of famotidine-BSA system
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3.3 表观结合常数和结合位点
静态猝灭是指荧光体与猝灭剂结合形成复合物导致荧光减弱的现象。对于静态猝灭,荧光体分子与猝灭剂之间的作用关系常用双对数方程[31]表示:
式中
由
表 2. 法莫替丁-BSA体系的表观结合常数与结合位点数
Table 2. Apparent binding constant and number of binding sites of famotidine-BSA system
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从
3.4 作用力类型的确定
药物与大分子之间的相互作用类型包括氢键、范德瓦耳斯力、静电引力和疏水作用力等。根据Ross等的研究结果可知[32],通过反应前后的焓变Δ
式中
表 3. 热力学参数表
Table 3. Thermodynamic parameter table
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从
3.5 能量转移及作用距离
根据Föster提出的非辐射能量转移机理(FRET)可知,当满足供能体可以发出荧光,供能体的荧光光谱与受能体的吸收光谱有足够的重叠部分,且供能体和受能体的最大距离不超过7 nm的条件时,将发生非辐射能量转移[34]。
能量转移效率
式中:
图 5. BSA的荧光发射光谱和法莫替丁的紫外吸收光谱
Fig. 5. Fluorescence emission spectrum of BSA and ultraviolet absorption spectrum of famotidine
式中
由
4 结论
采用荧光光谱分析法对法莫替丁-BSA系统的相互作用机制、作用力类型进行了定性分析。根据研究结果可知:法莫替丁对BSA的荧光淬灭类型为静态猝灭,两者之间的作用力主要是氢键和范德瓦耳斯力;依据双对数模型定量计算出结合位点数和不同温度下的表观结合常数
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