1 引言

近年来,迅速发展起来的表面增强拉曼散射(SERS)光谱克服了传统拉曼光谱中存在的拉曼信号微弱、检测灵敏度低、易受荧光干扰的缺点^[1-2],具有样品无需预处理、灵敏度和分辨率高等优点^[3-4]。SERS技术的诸多优点使它可以作为分子的识别探针,可用于衡量分子检测,并被广泛应用于环境监测、食品安全和生物医学等领域^[5-7]。

在SERS发展过程中,基底的制备极其重要,基底的重复性、稳定性、均一性等性能直接影响SERS技术的发展和应用。40多年来,世界各国的科学工作者们致力于研究各种结构的SERS基底,以制备出具有高增强因子、高灵敏度等优点的SERS基底。但是,开放的SERS活性基底存在拉曼检测结果可重现性较差、基底表面待测物易被污染、测试过程耗时长、实时在线性差等缺点。而微流控技术具有检测高效、样品微量、反应时间快、使用方便等优势^[8-9],将SERS技术与微流控技术结合可大幅度提高SERS检测的重复性和可靠性。目前,将微流控与SERS技术有效结合并形成微流控检测系统的方法主要有两种:一种是在微通道内以金属溶胶作为增强基底,将探针分子溶液与纳米金属溶胶在微通道内混合,进而对待测分子进行SERS检测^[10-12];另一种是以固定在微通道表面上的金属纳米粒子或结构作为增强基底,注入待测分子溶液,进而对待测分子进行SERS检测^[13-17]。

前期,本课题组^[18-22]通过物理法/化学法制备了碳纳米管阵列/薄膜-银纳米复合结构SERS基底,并对其SERS性能进行了一系列的研究。本文结合微流控技术和SERS技术,将优化的碳纳米管/银纳米粒子(CNTs/AgNPs)增强基底集成到微通道内,以罗丹明6G(R6G)作为探针分子,进行SERS实验研究。

2 实验制备

实验设计的微通道为“一字型”,长3 cm,宽200 μm,深150 μm。由于聚二甲基硅氧烷(PDMS)具有成本低、使用简单、粘附性好等优点,因此采用PDMS作为微通道的盖片,将载玻片作为微流控芯片的基片,让PDMS与载玻片自然键合成微流控芯片。同时,设计一个进样小孔和一个出样小孔,让待测溶液和CNTs/AgNPs液体按照一定比例混合后从进样小孔注入,通过移液器产生负压,保证溶液在微通道内顺利流动。

2.1 PDMS微通道制备

微通道模具的制备:通过软光刻技术制备PDMS微通道模具,根据苏州汶颢芯片科技有限公司提供的技术支持,其制备过程如下:1)在光滑的Si片上旋涂SU-8光刻胶,旋涂机转速为1250 r/min,之后加热烘烤30 min;2)加热后盖上“一字型”通道的掩模板,放置在汞灯下曝光10 min,汞灯功率为20 mW;3)曝光后再加热15 min,之后在室温下的显影液中浸泡显影10 min,并反复用显影剂冲洗;4)用显影剂清洗之后,对三甲基氯硅烷进行硅烷化处理,放置30 min,制得微通道模具,该模具可以重复利用。

PDMS微通道的制备和键合:实验采用模塑法制备PDMS微通道,制备流程如图1所示。制备过程如下:1)用无水乙醇和去离子水清洗乙醇瓶盖(为了节约PDMS,且利于后面的浇筑)、载玻片和玻璃棒等,自然干燥或放入真空干燥箱烘干后待用;2)称取乙醇瓶盖质量,向瓶盖内逐滴加入PDMS前聚物5 g,再逐滴加入固化剂(用于固化PDMS),固化剂的质量为0.5 g,让PDMS前聚物和固化剂的质量比满足10∶1是为得到理想的固化效果;3)用玻璃棒搅拌混合液体30 min,使其充分混合,然后在真空箱里静置20 min;4)在硅模的进样口和出样口放置直径约3 mm的导管,同时将混合液体浇筑到模具(避开导管)上,在真空箱中加热至90 ℃,固化60 min;5)取出固化好的PDMS,冷却后将硅模与PDMS分开,得到PDMS阳模;6)用乙醇和去离子水洗净PDMS阳模,待干燥后对应贴合在载玻片上,在室温下静置20 h,使其自然贴合。

图 1. PDMS微通道制备流程示意图。(a) PDMS胶制备;(b)微通道制备

Fig. 1. Diagrams of preparation processes of PDMS microchannel. (a) Preparation of PDMS glue; (b) preparation of microchannel

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2.2 CNTs/AgNPs制备和表征

CNTs/AgNPs制备方案:采用本课题组优化的实验方案^[20],首先配制0.5 mg/mL的碳纳米管悬浮液;然后采用化学还原法,将60 mg柠檬酸三钠和4 mg 硝酸银加入到27 mL CNTs悬浮液和3 mL去离子水的混合溶液中;放于磁力搅拌机上加热至95 ℃左右保持40 min;冷却后离心、洗净两次后待用。

CNTs/AgNPs样品的扫描式电子显微镜(SEM)结果及银纳米粒子的粒径分布情况如图2所示。从表征结果可以看出碳纳米管相互缠绕,银纳米粒子基本呈球形,且形貌均匀。为更进一步得到银纳米粒子的分布情况,利用Nano Measurement软件计算CNTs/AgNPs样品的粒径大小、数量等,其相应的粒径分布结果如图2(b)所示。统计结果表明银纳米粒子的粒径分布范围为15.7~54.8 nm,平均粒径 D-为33.9 nm,银纳米粒子的数量N为193。

图 2. CNTs/AgNPs基底的表征结果。(a) CNTs/AgNPs基底的SEM图;(b)银纳米粒子粒径分布图

Fig. 2. Characterization results of CNTs/AgNPs substrate. (a) SEM image of CNTs/AgNPs substrate; (b) size distribution of Ag nanoparticles

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2.3 微流控SERS器件制备

采用移液器产生负压的方法,将CNTs/AgNPs和R6G混合溶液通过进样小孔注入到PDMS微通道内以制备成微流控SERS器件。PDMS微通道实物图及拉曼共聚焦显微镜下的微通道图如图3所示。由图3(b)可以看出,CNTs/AgNPs样品在微通道内干燥后,其分布不太均匀,可能原因有CNTs本身易缠绕,分散性差,导致CNTs/AgNPs样品分散性差,在微观尺度下看到样品易团聚,后续将采用偶联剂来提高其均匀性;因为注入到微通道内的CNTs/AgNPs样品用量很少(μL量级),所以在干燥之后,观察到的CNTs/AgNPs样品就更少,这也导致CNTs/AgNPs样品的均匀性不好。

图 3. 微流控SERS器件。(a)实物图;(b)拉曼共聚焦显微镜下的微通道图

Fig. 3. Microfluidic SERS device. (a) Real product; (b) microchannel diagram under Raman confocal microscope

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3 拉曼测试及实验结果

光源参数:激光波长为532 nm,激光功率为50 mW,经10%功率衰减片后约为5 mW,物镜为50×长焦显微物镜,数值孔径NA为0.5,工作距离为10.6 mm,积分时间为2 s。通过课题组之前的实验经验,将SERS基底和R6G水溶液(浓度为10^-7 mol/L)按照体积比10∶1的比例混合后,其拉曼信号最强。因此按体积比10∶1混合溶液,并将混合液填充到微流控通道。

3.1 PDMS的影响实验

PDMS微通道、CNTs/AgNPs增强基底(开放SERS器件)及微通道内增强基底(微流控SERS器件)的探针分子的拉曼测试结果如图4所示。实验结果表明:在1000~3000 cm^-1频移段,PDMS的拉曼特征峰在2902 cm^-1和2963 cm^-1处,分别对应CH₃对称和不对称的拉伸振动^[23];在CNTs/AgNPs微流控SERS器件上可以测得全部的R6G和PDMS特征峰,对应的放大拉曼谱图如插图所示;SiO₂/Si基片上CNTs/AgNPs与R6G混合液(体积比10∶1)的拉曼光谱强度高于PDMS微通道内的CNTs/AgNPs与R6G混合样品。具体来说,在R6G拉曼频移1362 cm^-1处,SiO₂/Si基片上CNTs/AgNPs与R6G混合样品的拉曼强度为1619 counts,PDMS微通道内的CNTs/AgNPs与R6G混合样品的拉曼强度为260 counts,降低了83.94%,主要原因有:1)激光照射到PDMS表面再到达待测分析物时,由于PDMS对光的吸收和散射削弱了激光功率,从而降低了待测分子的SERS信号强度;2)由于注入到微通道内的是液体,在拉曼测试过程中无法精准聚焦,可能没有聚焦到理想焦平面,也会影响拉曼强度;3)对开放SERS基底进行拉曼测试时,其基片是SiO₂/Si,除基底的拉曼增强外,还有SiO₂膜使光在空气-基底-SiO₂层之间发生干涉引起的信号增强^[24],而PDMS微通道内获得的SERS信号是在玻璃基片上。

图 4. PDMS、CNTs/AgNPs基底和微流控SERS器件上R6G分子的拉曼光谱

Fig. 4. Raman spectra of R6G molecules of PDMS, CNTs/AgNPs substrate, and microfluidic SERS device

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3.2 不同位置的拉曼增强实验

在微流控SERS检测器件上按照图3(a)所示的位置点对其进行拉曼测试,测试结果如图5所示。由图5(a)可以看出,所有测试点都能测出比较明显的R6G和PDMS拉曼特征峰,同时位置点6处的R6G特征峰拉曼强度最强,相对点5的位置,其PDMS的拉曼强度较弱。具体分析可知:位置点1和点2的拉曼强度相较于其他点弱,可能是受到聚焦平面的影响;在点5的位置测出很明显的PDMS拉曼特征峰,根据微流控SERS器件从上到下的顺序,很可能是聚焦的时候聚焦到PDMS平面上,没有完全聚焦到CNTs/AgNPs增强介质上,导致R6G拉曼强度不是最强。为更直观地分析基底的均匀性,选取R6G频移在1510 cm^-1和1649 cm^-1处的拉曼强度进行统计和比较,结果如图5(b)所示,可以看出,不同位置上的R6G拉曼强度并不均匀,在点1处,强度约为30 counts,而在点6处,强度为80~100 counts。基于此,计算R6G拉曼特征峰在1510 cm^-1和1649 cm^-1处的相对标准偏差(RSD),分别是40%和46%,其最主要原因是在拉曼测试过程中,聚焦在哪个平面的问题会直接影响PDMS和R6G的拉曼特征峰强度;当然也存在CNTs/AgNPs基底本身的均匀性问题。

图 5. 不同位置的拉曼实验结果。(a)在微通道内随机选择6个点的拉曼光谱图;(b) 6个点在1510 cm-1和1649 cm-1处所对应的强度曲线图

Fig. 5. Raman experimental results at different points. (a) Raman spectra of the randomly selected 6 points in the microchannel; (b) intensity curves corresponding to the 6 points at 1510 cm-1 and 1649 cm-1

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3.3 不同时刻的拉曼增强实验

除此之外,还对微流控SERS器件在不同时刻的拉曼光谱进行了测试,随机选取一个位置点,以1 min为第一时间点开始测试,分别间隔不同时间,获得的拉曼光谱和在R6G频移1510和1649 cm^-1处的强度变化情况如图6所示。可以看出:1)每个时刻测得的R6G拉曼峰强度都很强,但只测得很弱的PDMS拉曼峰强度,这表明在对微流控SERS器件聚焦过程中,激光基本聚焦在CNTs/AgNPs平面;2)在R6G频移1510 cm^-1和1649 cm^-1处,随着时间的增加,R6G拉曼强度先增强,再逐渐降低,最后趋于稳定,其强度变化趋势与之前研究的开放SERS基底上探针溶液拉曼强度的变化情况相似。具体变化趋势如下:在3 min时,拉曼强度约为100 counts,之后拉曼强度逐渐增强;在14 min时,1510 cm^-1和1649 cm^-1处的强度分别约为830 counts和940 counts,达到最大值;之后拉曼强度呈现下降趋势,直到30 min后,拉曼强度趋于稳定。整个过程拉曼强度变化的原因可能是待测物的逐渐蒸发,这在文献[ 25]中已作详细分析。同时,其他位置点的不同时刻的拉曼强度也有类似的变化规律。

图 6. 不同时刻的拉曼实验结果。(a)同一位置,微通道内R6G随时间变化的拉曼光谱图;(b)在1510 cm-1和1649 cm-1处不同时间点对应的强度曲线图

Fig. 6. Raman experimental results at different time. (a) Raman spectra of R6G vary with time at the same position in the microchannel; (b) intensity curves corresponding to different time at 1510 cm-1and 1649 cm-1

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3.4 增强因子计算

为准确分析CNTs/AgNPs基底的拉曼增强效果,计算其增强因子(E_F),公式^[26]为

EF=ISERS/cSERSIRS/cRS,(1)

式中:I_SERS和c_SERS分别为SERS基底上R6G的拉曼强度和对应的浓度;I_RS和c_RS分别为没有SERS效应的基底上R6G的拉曼强度和对应的浓度。对于CNTs/AgNPs增强基底而言,在R6G频移1362 cm^-1处,测得浓度10^-7 mol/L所对应的相对拉曼强度为1619 counts,同时,在SiO₂/Si基底上,测得浓度10^-2 mol/L所对应的相对拉曼强度为116 counts,因此可得,E_F=(1619/116)×(10 ^-2/10^-7)=1.5×10⁶。

此外,还采用时域有限差分法(FDTD)对复合结构进行仿真。仿真参数设置如下:入射波长λ=532 nm,入射场强度E₀=1 V/m,周围介质n_medium=1,SiO₂薄膜厚度为300 nm,碳纳米管内径为20 nm,外径为50 nm,银纳米粒子粒径(D_Ag)和间距分别为35 nm和2 nm,其仿真结果如图7所示,仿真得到最大电磁场E_max=73.6 V/m。电磁场的增强因子计算公式为

EFEM≈Eout(ω0)4E04,(2)

式中:E_out(ω₀)为频率ω₀的纳米颗粒局域表面等离子体共振引起的增强的电场强度,即E_out(ω₀)=E_max;E₀为入射光的电场强度,即E₀=1 V/m,计算得E_FEM=2.9×10⁷。仿真的电磁增强因子高于实验的增强因子约1个数量级,主要原因是在实际基底拉曼测试实验中,得到的拉曼信号是光斑范围内的平均值,而仿真结果是根据最大电磁场强度计算获得的。

图 7. CNTs/AgNPs复合结构的仿真结果

Fig. 7. Simulation result of CNTs/AgNPs composite structure

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4 结论

基于化学还原反应法和模塑法制备CNTs/AgNPs增强基底和PDMS微通道,通过移液器的方法,将CNTs/AgNPs和R6G溶液(浓度为10^-7 mol/L)按照体积比10∶1填充到微通道内,对其进行拉曼测试实验。实验验证增强基底在微通道的拉曼测试的可行性,相较于开放的SERS器件,微流控SERS器件的拉曼信号下降了83.94%。除此之外,还对微流控SERS器件上不同位置和不同时刻的拉曼光谱进行测试,结果表明不同位置和不同时刻对应的SERS光谱强度不同,主要是受到聚集平面及待测分子蒸发过程的影响。后续将进一步研究微流控SERS器件的检测极限、均匀性及聚集平面的影响,同时也将引入光流控系统来减弱聚焦平面带来的影响。