1 引言

相干拉曼散射(CRS)成像,包括受激拉曼散射(SRS)成像和相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)成像,是一种基于四波混频(FWM)效应的三阶非线性光学过程,因其具有无标记、非侵入的特点,在生物样品分析、癌细胞识别和药代动力学等领域有着广泛的应用^[1-4]。与传统光学显微镜相比,CRS成像可以提供样品中丰富的化学组分信息,从而能够帮助科学家了解生命活动过程中各种物质成分的变化。与染色和荧光标记的方法相比,CRS成像避免了外加荧光标记物对生物细胞的影响及光致漂白损伤的问题,是一种更加安全和高效的方式^[5]。

为实现CRS成像,通常将两束超短脉冲(波长较短的脉冲称为抽运光,波长较长的脉冲称为斯托克斯光)同时照射到待测样品上,当这两束光的频率差所对应的能量与样品化学键的振转能级一致时,光子的能量被高效率地耦合到样品分子的振转能级上,这种共振作用使得两个抽运光子湮灭,同时产生一个斯托克斯光子与一个反斯托克斯光子,通过探测抽运光或者斯托克斯光的强度变化(SRS成像的信号探测),或者探测反斯托克斯光的强度(CARS成像的信号探测),就能实现物质分子的检测。实际应用中,CARS和SRS各有特点,SRS信号常用正向检测的方式,其中没有非共振背景噪声,信号强度与分子数目成正比,但是容易受到强抽运背景下的交叉相位调制、瞬态吸收和光热效应的干扰。CARS信号处在抽运光的低波长区,实际操作中,采用滤波片排除其他噪声的干扰较易实现,前向或背向探测方式适用于活体,基于此,本文主要讨论相干反斯托克斯拉曼散射^[6]。

相干反斯托克斯拉曼散射的实现需要两束超短脉冲的时间同步、空间重合、频差可调,最早是采用两台同步的钛宝石固体光源,或者钛宝石激光器抽运的固体光学参量振荡器(OPO)来实现相干反斯托克斯拉曼散射。基于钛宝石激光器的固体光源体积庞大,结构复杂,对环境敏感,要求恒温恒湿的超净使用环境,需要专业人员定期维护,这极大地限制了相干反斯托克斯拉曼散射技术的应用场合。近年来,研制基于光纤频率变换技术的新型光源逐渐成为本领域的研究热点。相比而言,光纤光源体积小,质量轻,环境稳定,光束质量好,应用潜力巨大^[7]。因此,国内外研究人员逐渐转向对光纤光源的研究。到目前为止,基于光子晶体光纤(PCF),发展出了基于超连续谱展宽(SCG)、孤子自频移(SSFS)^[8]和FWM的光纤式相干拉曼散射光源技术。基于SCG的光纤光源技术,是将飞秒脉冲耦合到PCF中,利用光纤中各种非线性效应产生超连续谱,进而实现宽谱带范围的拉曼峰探测。2017年,赵磊等^[9]基于PCF产生了光谱范围为460~1700 nm的超连续谱。但是,基于SCG实现的光源各波长处光谱密度低,非线性噪声大,光谱分辨率受限。最近有报道采取光谱聚焦的方式提高这类光源在非线性成像过程中的光谱分辨率^[10]。相对于SCG,将飞秒脉冲耦合到负色散光纤中,并依靠光纤中色散和非线性效应的相互作用实现频率转换的SSFS方式,可以实现时频域更稳定的超短脉冲,其转换效率可达到80%,功率谱密度更高,也可以通过改变入射光功率的方法对孤子的中心波长进行连续调谐^[11]。但是,基于SSFS的光纤光源得到的光谱宽度较宽,导致用于CARS成像时频谱分辨率受限,另外,对光纤负色散的要求导致在石英光纤中不能实现波长小于1250 nm的频率转换^[12]。相比上述两种方法,FWM是一种三阶非线性过程,类似于参量振荡,可以实现窄谱带激光的频率变换,对应激光脉冲的时域宽度在皮秒量级,更便于传输和探测。通过优化非线性介质和信噪比^[13]、操控相位匹配并采用FWM实现的信号光与闲频光之间的频差可以被精确操控,且覆盖大多数拉曼峰的范围。

2 国内外研究进展

1982年,Duncan等^[14]建造了第一台CARS显微镜,通过使用二维检测器在相位匹配方向上检测CARS信号。1999年,Zumbusch等^[1]通过高数值孔径的镜头紧密聚焦光束,弱化了相位匹配条件,获得了三维CARS显微成像。Cheng等^[15]不仅在理论上对CARS显微成像技术进行了研究,而且对前向探测、后向探测、偏振激发探测^[16]和显微层析CARS^[17]成像等进行了细致的实验研究。经过多年发展,应用于CARS显微成像技术的光源从最初的基于钛宝石的固体激光器或倍频Nd∶YVO₄激光器同步抽运的OPO发展出基于光纤的FWM效应^[18-19]、SSFS^[20-21]和超连续谱等光纤特有的频率转换方案。

2012年,Baumgartl等^[22]开发了一种基于单通式FWM的全光纤CARS显微镜,并成功获得甲苯的显微图像。同年,Ozeki等^[23]采用基于快速振镜的可调滤波器,实现了超光谱SRS。2013年,Lamb等^[24]研制出基于同步抽运OPO的光纤式CARS光源,实现了高质量老鼠组织的CARS成像。2014年,Gottschall等^[25]将单通式结构改造为环形参量振荡结构,实现了分辨率为1 cm^-1的高对比度、高频谱分辨的CARS显微成像。2016年,Brinkmann等^[26]在环形参量振荡腔的基础上,采用重复频率连续可调的固体光源作为抽运光,通过改变抽运光的重复频率,在8 μs的时间内,实现信号光在1130~1310 nm波段内的快速调谐,有望提高CARS显微成像的速度。2017年,Gottschall等^[27]进一步将环形参量谐振腔改造成线型腔,并通过在抽运激光器中加入可调谐滤波器和强度调制器,实现了聚苯乙烯小球的SRS。2018年,Shou等^[28]实现了基于正交偏振态的双偏振超光谱SRS,其在生物组织的快速活体检测方面有潜在的应用前景。

SSFS效应于1986年首次被发现^[20]。2006年,Andresen等^[11]利用钛蓝宝石激光器和PCF中的SSFS效应,研制了CARS显微成像所需的光源,探测波数达到4000 cm^-1,频谱分辨率为25 cm^-1。目前,采用SSFS产生脉冲宽度小于100 fs的可调谐脉冲,其更适用于飞秒CARS^[29]。超连续谱效应被广泛用于超短脉冲频率拓展方面^[30-31],2014年,谢晓亮教授团队通过将掺铒光纤激光器非线性展宽到1 μm波段再进行放大的方式,实现掺铒激光与掺镱激光的同步,再通过倍频获得765~795 nm与1010~1060 nm波段的可调谐皮秒脉冲,并将其用于SRS。由于SCG过程中的非线性噪声较大,后续采用平衡探测器抑制噪声,最终获得散粒噪声极限的成像探测灵敏度^[32]。

国内也有许多科研机构开展了CARS显微成像技术的研究工作,主要集中在使用固体激光器作为激发光源进行应用研究^[33-35],如:深圳大学对有机溶液的宽带振转光谱进行了测量^[36],哈尔滨工业大学对C—H键的动力学特征进行了研究^[37],复旦大学对阿尔茨海默病小鼠脑组织进行了双色快速成像^[38]等。2015年,江俊峰等^[39]研制了用于CARS成像的窄线宽、低重复频率全光纤皮秒脉冲种子源,并研究了腔长和光纤光栅带宽对脉冲稳定性和脉冲宽度的影响。同年,Yuan等^[40]基于双零色散的PCF,实现了酒精样品的CARS光谱测量。2016年,Chen等^[41]用光纤激光器抽运PCF,基于光谱聚焦机制提出了一种使用双孤子作为斯托克斯脉冲的CARS光谱无背景检测装置。同年,Wang等^[42]基于时间透镜效应,提出了用于相干拉曼散射的新型同步激发光源技术。2018年,赵君等^[43]对光纤飞秒激光抽运的非线性光学频率变换研究进展进行了详细的介绍,让研究人员能够更加清楚CARS显微成像光源频率变换的机理与方法。

3 低重复频率光纤参量振荡器

光纤参量振荡器(FOPO)是以PCF作为参量转换介质的OPO,具有可调谐、转换效率高的特点,在生物光子学和超快光谱学中有着广泛的应用,其与传统OPO的区别在于它们依赖于腔内光纤的增益来支持信号光的振荡^[7]。用于CARS显微成像光源的FOPO的主要结构如图1所示,包括抽运激光器、耦合器、PCF、输出分束器(OC)和延时线。抽运激光器的输出光经过耦合器入射到PCF,在其中发生FWM效应,实现激光频率变换,产生信号光和闲频光。输出分束器将一部分信号光输出,将另一部分信号光反馈到延时线中,通过精确调节延时线的长度,抽运脉冲和反馈的信号脉冲在时间上重合并经过耦合器进入PCF,信号光获得增益,从而形成振荡。

图 1. 用于CARS显微成像的FOPO

Fig. 1. FOPO used for CARS microscopy

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FOPO的优势在于:

1) 转换效率高。相对于单通式的FWM,FOPO将微弱的信号光再次耦合到PCF中进行谐振,有效提高了信号光的转换效率。

2) 调谐范围宽。信号光经过反馈腔中的延时线,在色散效应的作用下,脉冲宽度被展宽,在脉冲包络的不同位置对应着不同的频率成分。展宽后的信号光和抽运光再次被耦合到PCF中,由于信号光的脉冲宽度大于抽运光,抽运光在时域上仅能覆盖特定频率的信号光,该频率处的信号光获得增益,实现谐振。通过改变抽运光和信号光的延时,可以连续选择特定的信号光频率,基于色散滤波效应实现宽带调谐。

3) 时空自重合。CARS是一种非线性过程,需要把两束光同时入射到样品的同一位置,通常搭建延时光路实现两束光的精确时间同步,用二向色镜将两束光耦合在一起,实现两束光的空间重合。基于FWM的FOPO中,信号光和抽运光发生非线性作用后同时从输出分束器出射,具有时间自同步、空间自重合的特性,大大降低了后续同步光路的要求,实际应用更方便。

生物成像光源的重复频率与样品损伤、穿透深度、信号质量有直接的关系。实际应用中,通常根据样品的具体情况选择最优的重复频率。现有的钛宝石固体激光系统的重复频率一般为几十兆赫兹,用于CARS成像时,更适合于人工培养细胞等稀疏的细胞。而对于鞘髓等稠密生物样品细胞,研究表明,采用1~4 MHz的低重复频率激发光源能有效减小细胞损伤^[44]。因此,本课题组主要围绕低重复频率FOPO,针对实际应用中的脉冲宽度、光谱分辨、波数范围和光源尺寸,开展腔外压缩、光谱窄化、谱带拓展和全光纤集成方面的工作。

3.1 从皮秒脉冲到飞秒脉冲

970~1025 nm波段处在镱离子和钕离子的增益谱带之间,目前尚没有较好的办法通过掺镱或掺钕光纤振荡器直接产生970~1025 nm波段的光。2018年,本课题组结合PCF(LMA-PM-5)的色散特性,经过理论计算,发现采用零色散波长附近的抽运光可以产生974 nm的信号光;通过搭建FOPO进行验证,实现了970~1025 nm波段的可调谐激光输出,再结合腔外光栅对补偿色散,最终实现该波段脉冲宽度为亚皮秒量级的超短脉冲^[45]。

FOPO的实验装置如图2(a)所示,其中HWP为半波片,PBS为偏振分束器,DM为二向色镜,QWP为1/4波片。抽运激光器是中心波长为1064 nm的自制皮秒激光器,采用半导体可饱和吸收体实现锁模,通过全保偏光纤放大器和声光调制器进行功率放大及重复频率选择,最终实现重复频率为0.8 MHz、脉冲宽度为20 ps、输出功率为1.0 W的激光脉冲,并将其作为FOPO的抽运光。PCF的种类是LMA-PM-5,其零色散波长为1053 nm,实验所用PCF的长度为36 cm。输出耦合器由偏振分束器和半波片组成,通过旋转半波片可以改变输出比。光学延迟线由260 m的延时光纤和延时电机组成,前者用于粗略调节光学延迟,后者用于精细调节光学延迟。通过优化延时光纤的长度和调整延时电机,使得光纤参量振荡腔的本征重复频率和抽运激光器的重复频率完全相同。二向色镜的作用是将抽运光与经过延时线的信号光再次耦合到PCF中。为了压缩输出光脉冲,腔外使用了一对线宽为1250 lines/mm的透射光栅进行色散补偿,光栅之间的距离约为12 cm。

基于已有的理论模型^[46],计算了不同抽运波长下的信号波长,如图2(b)所示。1064 nm的抽运波长对应的理论信号波长为974 nm。同时,当抽运波长接近零色散波长时,FWM增益的带宽可以显著被展宽^[47]。因此,基于FOPO的增益及色散滤波作用,可以实现974 nm波段信号光的选择性放大及连续调谐。实验结果如图3所示,其中图3(a)为不同波长处信号光功率的变化,可以得出功率最高的波长在990 nm处,最大功率为26 mW;图3(b)为经过光栅压缩后982 nm处信号光的脉冲宽度和光谱,采用洛伦兹曲线拟合,脉冲宽度为800 fs,光谱宽度为3.8 nm,如图3(b)中插图所示,对应的傅里叶变换极限脉冲宽度为373 fs,实验得到的脉冲宽度为傅里叶变换极限脉冲宽度的2倍,出现该现象的原因主要是260 m延时光纤中累计的高阶色散没有被补偿。

图 2. 实验装置与相位匹配曲线。(a) FOPO的实验装置;(b)利用不同抽运波长计算的信号波长

Fig. 2. Experimental setup and phase matching curve. (a) Experimental setup of FOPO; (b) calculated signal wavelength for different pump wavelengths

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图 3. 实验结果。(a)信号脉冲不同波长处的输出功率;(b)信号脉冲的脉冲宽度及光谱

Fig. 3. Experimental results. (a) Output powers of signal pulse at different wavelengths; (b) pulse duration and spectrum of signal pulse

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3.2 从参量振荡到参量放大

为了提高CARS显微成像的光谱分辨率,需要更窄光谱的激发光源,其对应的傅里叶变换极限脉冲宽度更宽,因此,实验采用140 ps的抽运激光器,并搭建了对应的FOPO。但是,随着脉冲宽度的增加,对应的脉冲峰值功率下降,仅通过FOPO产生的信号光功率较低,不足以实现CARS显微成像。为提高信号光的输出功率,在FOPO的基础上增加了一个光纤参量放大器(FOPA)^[48],实验装置如图4所示。FOPO和FOPA由自制的掺镱光纤激光器抽运,抽运激光的中心波长为1030 nm,重复频率为0.8 MHz,平均功率为2.0 W,光谱宽度和脉冲宽度分别为1.0 nm和140 ps,经过偏振分束器分成两部分,分别驱动FOPO和FOPA。

图 4. 光纤参量振荡器和放大器

Fig. 4. Fiber optical parametric oscillator and amplifier

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FOPO由36 cm长的PCF(PCF1)、输出分束器、256 m的无源光纤(PM 980)和可调延时电机1(delay stage 1)组成。在0.8 W抽运光的作用下,输出信号光的平均功率为5.0 mW,并将其作为FOPA的种子光。FOPA由38 cm的PCF(PCF2)和可调延时电机2(delay stage 2)组成。PCF用作参量增益介质,延时装置2用来实现种子光和抽运光之间的时间重合。

图5(a)为单次光参量产生(FOPG)、FOPO、FOPA的输出信号光光谱,其光谱宽度分别为5.0,3.0,1.1 nm,对应的输出功率分别为6.0,9.0,26.0 mW。可以看到,通过光纤参量振荡与放大,有效提高了信号光的输出功率,优化了其光谱宽度。

图5(b)为FOPG、FOPO、FOPA中信号脉冲的输出功率随抽运功率的变化关系。在FOPG与FOPO中,信号光功率都随抽运功率呈线性增加,两者的抽运阈值相同,均为0.6 W。由于FOPO将部分信号光再次反馈并增强,其斜率效率大于FOPG。在FOPA中,当抽运功率较低时,参量增益很小,种子光以恒定的损耗通过PCF2;随着抽运功率的提高,FWM过程开始占据主导地位,使得种子光获得增益,输出功率逐渐提高。与FOPO相比,FOPA不仅提供了3倍的平均功率放大,而且还将信号光谱宽压窄为原来的1/3,从而使光谱强度增强了9倍,最终实现输出功率为26 mW、光谱宽度为1.1 nm的信号光,剩余抽运光的光谱宽度为3.2 nm。通过光纤参量振荡加放大的方式,实现了时间同步、空间重叠的窄带双色超短脉冲输出,峰值功率约为几百瓦,能够满足CARS显微成像的需求。

图 5. 实验结果。(a) FOPG、FOPO、FOPA的信号脉冲光谱;(b) FOPG、FOPO、FOPA中放大信号脉冲的输出功率随着抽运功率的演变

Fig. 5. Experimental results. (a) Spectra of signal pulses for FOPG, FOPO and FOPA; (b) evolution of output powers of amplified signal pulses in FOPG, FOPO and FOPA as function of pump power

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3.3 从高波数拉曼区到指纹拉曼区

受限于PCF的色散参数,现有的基于LMA-PM-5的CARS显微成像光源,仅能实现3000 cm^-1附近的振转能级探测,要实现其他波数的探测需采用调谐抽运光或更换不同型号PCF的方法。前者需要在抽运激光器内加入调谐器件,容易导致锁模失锁;后者对光纤种类的要求更高,更换光纤也比较繁琐。对于保偏PCF而言,可以通过调节入射光的偏振态,选择不同的相位匹配条件,实现新的信号光谱带。2018年,本课题组报道了在可调谐FOPO中,使用FWM不同信号光谱带的偏振开关^[49],可产生780~791 nm和960~1000 nm波段可调谐的激光脉冲,实验装置如图6所示,其中 WDM为波分复用器,LD为激光二极管。

图 6. FOPO的实验装置

Fig. 6. Experimental setup of FOPO

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FOPO由1030 nm脉冲激光器抽运,重复频率为2 MHz。FOPO包括掺镱双包层光纤放大器、48 cm的PCF、输出分束器、98 m的延时光纤、可调延时电机和光纤波分复用器。双包层光纤放大器用于将抽运激光器的平均功率从5 mW提高到1.5 W,对应的光谱宽带为1.0 nm,脉冲宽度为40 ps。

通过改变输入抽运光的偏振态方向和光纤双折射轴的角度,可满足PCF中FWM的不同相位匹配条件,从而使FWM在标量调制不稳定(SMI)和交叉相位调制不稳定(XPMI)之间切换,形成偏振开关。根据Zlobina等^[46,50]提出的模拟方法计算了SMI和XPMI相位匹配条件的参量增益。各种入射光偏振方向的理论参量增益如图7(a)所示,虚线和实线分别对应抽运光的偏振态方向与PCF的快轴和慢轴重合时的SMI过程,点线对应抽运光的偏振态方向与PCF的快慢轴夹角为45°时的XPMI过程。计算结果表明,通过调节抽运光的输入偏振态方向,可以实现3个参量边带的产生。图7(b)为不同参量边带内,通过改变延时,得到的输出信号光的调谐范围。如图所示,信号光可以分别在780~791 nm和 960~1000 nm 两个波段范围进行连续调谐。前者位于SMI边带,后者位于XPMI和拉曼诱导的反斯托克斯边带。SMI过程的波长调谐范围明显小于XPMI的波长调谐范围,这是由这两个过程的增益带宽不同引起的。实验证明,抽运光的偏振方向可以作为一种开关,用来选择FWM过程时由相位匹配条件决定的不同增益谱带,结合反馈回路能够实现谱带内信号光波长的连续调谐,这种大范围切换、小范围调谐的能力,可以为CARS成像应用于高波数区和指纹波数区的快速、多次测量提供更加灵活的工具。对比第3.1节中介绍过的FOPO(抽运波长为1064 nm),本实验所采用的抽运光中心波长更短(抽运波长为1030 nm),导致通过FWM效应产生的信号光中心波长也向短波移动。同时,抽运波长与PCF的零色散波长(1053 nm)差得更远,由相位匹配条件决定的参量增益谱带也更窄,导致调谐范围减小。

图 7. 参量增益谱与可调范围。(a)参量增益谱;(b)调节延时电机时输出的不同波长

Fig. 7. Parametric gain spectra and tunable range. (a) Parametric gain spectra; (b) wavelength tuning results by changing delay stage

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3.4 从腔外放大器结构到腔内放大器结构

光纤式的CARS显微成像光源相对于固体光源的一大显著优势就是可集成,之前的报道中,抽运激光和反馈腔都是采用光纤光路,但是PCF的耦合还是采用空间光路,这成为全光纤化CARS显微成像光源的一大难点,瓶颈在于光纤耦合器件引起的色散会对参量过程产生不利影响。为了解决该问题,提出了一种新的有源反馈腔结构,将光纤放大器置于OPO腔内^[51],装置如图8(a)所示,其中PC为偏振控制器。全光纤集成的FOPO由两部分组成:抽运激光器和反馈腔。抽运激光器输出中心波长为1030 nm、光谱宽度为0.2 nm、脉冲宽度为30 ps的超短激光。反馈腔包括主放大器、PCF、光纤延迟线、输出分束器和WDM。主放大器的增益光纤为0.3 m,抽运吸收系数为1200 dB/m,腔内PCF的长度为0.4 m。根据反馈腔中主放大器的相对位置,实验测试了两种反馈腔结构,一种称为腔外放大器结构(AOC),另一种称为腔内放大器结构(AIC)。在AOC结构中,首先将低功率抽运脉冲耦合到主放大器中,经过放大的脉冲通过WDM耦合到PCF并进行参量转换,WDM的尾纤长度设定为0.5 m。在这种情况下,主放大器的增益和PCF之间的WDM将引入不利的非线性效应。对于AIC结构,低功率的抽运脉冲首先通过WDM,然后进入主放大器和PCF中,主放大器的增益光纤直接与PCF熔接,这就从结构上避免了耦合器件尾纤引入的非线性效应。受益于改进结构的低噪声和全光纤耦合的特点,本课题组将包括电子元件在内的整个系统集成在一个尺寸为39 cm×28 cm×13 cm的铝盒中,如图8(b)所示。盒子中装有三个抽运LD,用于抽运光纤振荡器、前置放大器和主放大器。所研制的激光光源中的所有元件都是光纤器件,可确保输出脉冲的长期稳定和免维护特性。

图 8. 实验装置与实物图。(a) FOPO的实验装置;(b)全光纤集成CARS光源实物图

Fig. 8. Experimental setup and physical diagram. (a) Experimental setup of FOPO; (b) photo of all-fiber integrated CARS source

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图9(a)为重复频率在3 MHz时,两种反馈腔结构输出的抽运光和信号光的光谱,由于抽运光放大后峰值功率较高,其光谱表现出明显的自相位调制边带。对比两种结构的输出光谱,可以看出:AIC方案的光谱宽度更窄,说明该方案对耦合器件引入的非线性噪声进行了有效抑制。图9(b)是两种方案下信号光的输出功率曲线。由图可知,AIC方案的输出功率明显高于AOC方案,且发生FWM效应所需的抽运光阈值更低。

图 9. 实验结果。(a) AIC和AOC装置中FOPO的光谱;(b) AIC和AOC装置中的输出功率曲线

Fig. 9. Experimental results. (a) Spectra of FOPO in AIC and AOC configurations; (b) output power curves of AIC and AOC configurations

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3.5 从光谱分析到光谱成像

采用上述低重复频率光源,搭建了乙醇样品拉曼光谱的测试光路。激光脉冲的重复率设定为1 MHz,用于CARS成像的抽运光功率为5.0 mW,波长范围为788~797 nm,斯托克斯光的功率为3.0 mW,中心波长为1030 nm。实验装置如图10所示,通过750 nm长通滤波器(LP750)对输出脉冲进行滤波,滤除PCF中的自发FWM边带。使用两个相同的20倍显微镜物镜进行激光的聚焦和反斯托克斯信号光的收集。收集到的信号光通过700 nm短通滤波器(SP700)和焦距为50 mm的透镜耦合到光纤光谱仪(HR4000,Ocean Optics,新西兰)中。

图 10. CARS光谱探测装置示意图

Fig. 10. Schematic of setup for CARS spectroscopy

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通过仔细调整焦点位置和激光波长,检测到646 nm附近的乙醇样品的反斯托克斯信号。如图11(a)所示,对检测到的CARS信号进行处理后,获得了2830~2980 cm^-1的乙醇样品CARS光谱,2900 cm^-1附近的拉曼峰对应于CH₂和CH₃的振动能级,验证了所研制光源在CARS检测中的应用能力。另外,将集成后的光源运输到复旦大学,在商售显微成像系统上实现了对小鼠耳朵样品的CARS成像,如图11(b)所示,能够清晰看到小鼠耳朵皮下脂肪细胞的分布。

激光器的脉冲宽度、谱宽、重复频率等输出参数相互影响,在实际应用中,往往需要同时考虑多个参数,才能实现最优的激发效果。为此,德国莱布尼兹光子技术研究所针对CRS成像在穿透深度、细胞损伤、成像速度、光谱分辨率等方面的实际需求,指出理想的激发光源应满足:脉冲宽度在15~1.5 ps之间;对应光谱分辨率在1~10 cm^-1之间;调谐范围覆盖0~4000 cm^-1;重复频率范围为1~8 MHz;体积小巧;可在非光学实验室的一般环境下稳定工作^[29]。本课题组围绕上述目标,分别通过腔外压缩实现20~0.8 ps的脉冲宽度,通过参量放大实现光谱分辨率从77 cm^-1(5.0 nm)到15 cm^-1(1.0 nm)的窄化,通过矢量相位匹配实现调谐范围从高波数区到指纹区的拓展,通过参量腔内放大实现全光纤集成,并演示了该类光源在CRS方面的应用效果。

图 11. CARS光谱与图像。(a)用AIC方案检测的乙醇样品的CARS光谱;(b)小鼠耳朵皮下脂肪组织的CARS图像

Fig. 11. CARS spectrum and image. (a) CARS spectrum of ethanol sample for AIC scheme; (b) CARS image of mouse ear adipose tissue

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4 结论

主要基于FWM的FOPO,介绍了课题组在脉冲压缩、谱宽优化、谱带拓展以及全光纤集成方面的工作。采用该方案产生的双色超短脉冲,重复频率一般在1~4 MHz之间,脉冲宽度为几十皮秒,调谐范围覆盖高波数拉曼区和指纹区,双色脉冲从同一根光纤输出,时间上自同步,空间上自重合。这些特性对于将相干拉曼散射应用到临床具有现实意义。在相同的峰值功率与脉冲宽度的前提下,激发光的重复频率越低,照射到生物样品上的平均功率就越低,引起的热效应就越低;同时,低重复频率激发光对于稠密细胞样品的非线性光致损伤也更低,因此能够有效降低成像过程对细胞样品的损伤。此外,皮秒脉冲在光纤中传输时,相比飞秒脉冲,色散和非线性效应引起的脉冲畸变会大幅减小,更适合采用光纤或者内窥装置将激发光引至病灶部位,实现实时在线成像与诊断。双色脉冲时空自重合的特性极大简化了传统实现相干反斯托克斯拉曼散射所需要的复杂同步措施,在简化光源结构的同时,有效提升了临床实用的稳定性。

相干拉曼散射技术已经在基础研究和生物医学方面取得了许多有价值的研究成果,将该技术推广到临床,不仅需要在光源方面不断优化,还需要在信号接收、快速检测、灵敏探测、光谱数据分析与处理等方面开展工作。通过设计更为紧凑的微型化探针、优化成像速度与灵敏度、选择新的光学窗口降低光致损伤以及开发新的算法快速处理光谱数据等措施,CRS成像必将成为研究生物医学、药代动力学、材料科学的有力工具^[6]。