1　引言

免疫荧光成像^［1］以直观可视、高特异性标记等特性在细胞生物学研究中广泛应用。常见的免疫荧光标记方法包括直接法^［2］和间接法^［3］。直接法通过带荧光探针的一抗直接标记目标蛋白分子，并采集荧光信号对其进行成像。而间接法通过一抗标记目标蛋白，再使用带荧光探针的二抗去标记一抗，形成抗原-一抗-荧光二抗复合物。由于二抗是物种特异性，相同的二抗可标记不同的一抗，使用起来更加灵活，因此间接法在多色成像中的适应性更强。

传统荧光成像受衍射极限限制，分辨率只有200 nm，而本世纪初提出的超分辨成像的分辨率达数纳米，极大地促进了人们对亚细胞结构与功能的研究^［4-8］。其中单分子定位成像（SMLM）因分辨率最高、原理易懂、光路易搭建、工作方式易掌握等优点，迅速发展为主流的超分辨成像技术^［9-12］。SMLM包括随机光学重构显微术（STORM）^［13］、光激活定位显微术（PALM）^［14］及纳米尺度点累积形貌成像（PAINT）^［15］。其中STORM基于免疫荧光标记，是利用二抗偶联具有闪烁能力的荧光探针进行单分子定位的成像技术，由于抗体技术的成熟，是应用较多的SMLM。多色STORM^［16］在揭示生物分子互作关系方面发挥着重要作用。Xu等^［17］通过双色STORM成像，揭示了神经元轴突上微丝-帽蛋白复合物与血影蛋白交替构成的间距为180~190 nm的周期性结构。Lopes等^［18］通过双色STORM成像观察到人巨噬细胞活化时Fcγ受体与信号调节蛋白α的分离。Hu等^［19］通过双色STORM成像，阐明了巨噬细胞伪足小体结构中肌球蛋白和桩蛋白90 nm的轴向高度差。然而，STORM超高的分辨率也对抗体的特异性提出了更高的要求，尤其是双色成像中二抗物种特异性。为了提高二抗的物种特异性，在生产时需要对其进行预吸附。低吸附二抗可能会结合不同物种抗体，导致双色STORM两个通道之间出现信号串扰。亟需发展有效的评估二抗物种特异性的方法，避免实验假象的发生。

经典的红细胞骨架具有三角晶格网络结构，其中血影蛋白N端在网络的节点处，血影蛋白C端在网络的中间处，二者在空间上具有明确的互斥位置关系^［20］，这为判断双色成像结果中蛋白互作关系的正确性提供了良好的参照。因此，本文基于红细胞骨架结构模型，选择血影蛋白N端和C端进行双色STORM成像，通过模拟和实验探究低吸附二抗对成像结果的影响。

2　原理与方法

2.1　免疫荧光标记和二抗预吸附原理

抗体一般呈“Y”字形结构，“Y”的两臂末端为抗原结合片段（Fab），柄部为结晶片段（Fc），如图1（a）所示。二抗通常与一抗的Fc段相结合，Fc段与物种来源相关，因此需根据一抗的物种来源选择相应抗该物种的二抗。然而实际情况中二抗往往会与非特异性物种的一抗结合。此外，为了起到放大信号的作用，二抗一般是多克隆抗体，结合到一抗Fc段的多个不同位点后，导致特异性不够显著，如图1（a）所示。因此，与一抗相比，二抗的特异性较弱，在生产二抗时需要对其进行预吸附处理提高物种特异性。

图 1. 免疫荧光标记与二抗预吸附原理示意图。（a）直接与间接免疫荧光标记法；（b）二抗预吸附过程；（c）二抗发生交叉反应

Fig. 1. Immunofluorescent labeling and secondary antibody pre-adsorption. (a) Direct and indirect immunofluorescent labeling methods; (b) secondary antibody pre-adsorption; (c) cross-reactivity of secondary antibodies

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预吸附指对二抗与潜在非特异性结合物种的固定蛋白血清进行接触的处理，保留未结合的二抗，进而提高二抗物种特异性，图1（b）所示。当二抗预吸附不充分，使用间接法同时标记目标生物分子时，低吸附二抗会结合其他种属的一抗或二抗，导致信号串扰，如图1（c）所示。

2.2　人红细胞膜骨架的STORM成像

人成熟红细胞结构简单，仅有一层膜及依附于膜的三角晶格网络状的细胞骨架结构，内部填充着血红蛋白，呈双凹圆饼形状，直径约为8 μm，边缘和中心厚度分别约为2.8 μm和1 μm，如图2（a）所示^［21］。红细胞膜骨架的主体是由肌动蛋白连接体复合物（actin junctional complexs）和血影蛋白（spectrin）构成的三角晶格网络。其中血影蛋白包含两个相似的亚基，即α亚基（α-spectrin）和β亚基（β-spectrin），二者反平行排列，螺旋缠绕形成异二聚体。异二聚体再头对头结合，形成四聚体，这些四聚体构成三角晶格网络的每一条边。肌动蛋白连接体复合物是三角晶格网络的节点，每个节点与最邻近节点的距离约80 nm，如图2（b）所示^［20］。β-spectrin N端与肌动蛋白复合物结合，位于四聚体两端，而C端则位于四聚体中间，因此二者之间的距离大约为40 nm。二者这种确定的互斥位置关系为双色成像时判断二抗信号串扰提供了参照。

图 2. 红细胞骨架结构和互相关分析流程。（a）红细胞形貌示意图，插图为依附于膜内侧的三角晶格网络状的膜骨架示意图；（b）红细胞骨架模型；（c）互相关分析算法流程

Fig. 2. Schematic of erythrocyte skeleton and flowchart of the cross-correlation analysis algorithm. (a) Morphology of erythrocyte. The inset shows the membrane skeleton in the form of a triangular lattice network; (b) model of erythrocyte skeleton; (c) flowchart of the cross-correlation analysis algorithm

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由于正常红细胞β-spectrin C端密度过高，故利用超微结构保留的膨胀显微技术（U-ExM）膨胀红细胞（约膨胀4.3倍），然后对膨胀后的β-spectrin N端和C端进行双色STORM成像^［22］。利用自主搭建的STORM成像系统对制备好的样品进行信号采集，首先寻找到合适的成像视野，选择2 kW/cm²功率密度的激光激发该视野范围内的荧光分子，使之发生稀疏闪烁，并依次对两个通道进行采集。期间适当加入低强度紫外光，以提高荧光闪烁能力。每个通道约采集50000帧图片，随后使用单分子定位算法对每一帧图片中的离散荧光分子进行精准定位，叠加所有定位后的坐标点，并进行漂移校正，最终得到重构的高分辨率STORM图像。

2.3　互相关分析

互相关分析通常用于分析双色STORM成像后两个通道点簇之间的相互关系。互相关分析是通过对两个通道的点进行距离相关性的量化，来揭示它们在空间上的关联性的过程。首先，对于每一对来自两个通道的点，计算它们之间的成对距离，然后统计半径为r、宽度为dr的环形区域内的成对点数，再通过与该区域的平均成对点数进行比较得到互相关系数，以此对两个通道的点进行距离相关性的量化。互相关函数^［23］为

式中：r是两个不同通道点的成对距离；M（r）是半径为r、宽度为dr的环形区域内的成对点数；ρ₀为整个互相关区域内成对点数的平均密度；ΔA（r）是环形区域的面积；W（r）是整个互相关区域的径向平均自相关系数。ρ₀ΔA（r）W（r）代表两通道的点随机分布时半径为r、宽度为dr的环形区域内的成对点数，用以对M（r）进行归一化。图2（c）所示的互相关分析算法流程为：输入两个通道的数据，计算两通道点与点之间的距离，然后根据设定的环形区域宽度dr获得不同环形区域的成对点数M（r）以及计算两通道的点随机分布时不同环形区域的成对点数ρ₀ΔA（r）W（r），最后利用互相关函数计算出不同环形区域的互相关系数。互相关系数越高则代表两个通道点簇在此处的共定位关系越强。若互相关系数大于1，代表两个通道点簇之间存在共定位；若互相关系数接近1，代表两个通道点簇之间关系随机；若互相关系数小于1，代表两个通道点簇之间存在互斥^［23-24］。

3　结果与讨论

3.1　双色STORM成像中信号串扰的模拟和分析

首先利用Matlab软件模拟了有无信号串扰时红细胞膜骨架蛋白β-spectrin N端和C端的双色STORM成像结果，并通过互相关算法进行分析。具体步骤如下：在20 μm×20 μm的区域内生成间距为320 nm的三角晶格网络来模拟膨胀约4.3倍后的红细胞骨架，设置两个通道，分别代表红细胞膜骨架蛋白β-spectrin N端（红色）和C端（蓝色）；基于红细胞膜骨架存在15%的扰动^［25］，对其中一个通道的点簇设定该定位扰动，再通过移除两个通道60%的点簇来模拟真实情况下的数据缺失。根据STORM的单分子定位成像原理以及其20 nm的分辨率，将每个点簇的点数设为20，其内部点坐标的标准差设为10 nm，得到最终STORM成像的模拟定位数据，如图3（a）所示。图3（b）所示的局部放大图显示出典型的三角晶格网络，通过互相关分析发现，互相关系数在初始位置小于1，代表两通道点簇之间是互斥位置关系。互相关系数较大的位置约为150 nm，接近三角晶格骨架周期长度的1/2，如图3（c）所示。同时，最近距离统计峰值对应的横坐标约为172 nm，同样接近三角晶格骨架周期长度的1/2，如图3（d）所示，与设定模型相符。

图 3. 红细胞β-spectrin N端和C端的双色STORM成像的模拟。（a）没有信号串扰时的双色STORM成像结果的模拟；（b）图3（a）的局部放大；（c）图3（a）中两个通道点的互相关分析；（d）图3（a）中两个通道中点的最近距离分析；（e）1%信号串扰时双色STORM成像结果的模拟；（f）图3（e）的局部放大；（g）~（l）1%、5%和10%信号串扰时的互相关和最近距离分析

Fig. 3. Simulations for two-color STORM imaging of erythrocyte β-spectrin N-terminal and C-terminal. (a) Simulation of two-color STORM imaging with zero cross-reactivity; (b) local magnification in Fig.3(a); (c) cross-correlation analysis between points in two channels in Fig.3(a); (d) nearest neighbor analysis between points in two channels in Fig.3(a); (e) simulation of two-color STORM imaging with 1% cross-reactivity; (f) local magnification in Fig.3(e); (g)‒(l) cross-correlation analysis and nearest neighbor analysis with 1%, 5%, 10% cross-reactivity

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随后，对其中一个通道添加另一个通道1%的共定位点来模拟真实的1%信号串扰情况。得到的双通道定位数据如图3（e）所示，图3（f）所示的局部放大图显示两个通道的点存在部分共定位情况，得到的互相关系数在初始位置大于1，代表两通道点簇之间存在共定位关系，如图3（g）所示。考虑到抗体的摆动，设置串扰信号点的定位扰动为10 nm，所以当发生信号串扰时，两通道之间存在部分点簇重叠，最近距离分析会在10 nm附近出现峰值，如图3（h）所示。随后又模拟了5%和10%信号串扰的情况，发现初始位置的互相关系数（大于1）、最近距离在约12 nm处的峰值都随着信号串扰比例的增加而增大，如图3（i）~（l）所示，表明信号串扰导致模拟结果中β-spectrin N端和C端出现共定位关系假象，且共定位比例随着信号串扰比例的增加而增大。

3.2　双色STORM成像中低吸附二抗造成实验假象

随后，分别使用高、低吸附二抗标记β-spectrin C端（洋红色），并使用高吸附二抗标记β-spectrin N端（青色），首先进行双色普通免疫荧光成像，如图4（a）和图4（b）所示，通过计算Manders共定位系数和Spearman秩相关系数来评价两个通道的共定位关系，发现低吸附情况下Manders共定位系数M^C和M^N分别为0.479±0.150和0.495±0.206，Spearman秩相关系数S为0.340±0.092，高吸附情况下M^C和M^N分别为0.469±0.017和0.406±0.035，S为0.363±0.022，如图4（c）所示。这些结果表明，双色普通免疫荧光成像对二抗物种特异性不敏感，且高、低吸附二抗均得到β-spectrin N端和C端具有一定共定位关系的错误结果。这可能是因为膨胀后β-spectrin N端和C端的距离约为160 nm，小于衍射极限，使得普通免疫荧光成像时难以区分，导致两者呈共定位关系。

图 4. 二抗物种特异性对双色普通免疫荧光成像和STORM成像的影响。（a）（b）低吸附和高吸附二抗标记的红细胞β-spectrin N端和C端的双色普通免疫荧光图像；（c）图4（a）和图4（b）中5个不同区域的Manders共定位和Spearman秩相关分析；（d）图4（a）对应的STORM图像；（e）图4（d）的局部放大；（f）（g）图4（d）矩形框区域的互相关和最近距离分析；（h）图4（b）对应的STORM图像；（i）图4（h）的局部放大；（j）（k）图4（h）矩形框区域的互相关和最近距离分析

Fig. 4. Effect of secondary antibody species specificity on two-color conventional immunofluorescence and STORM imaging. (a)(b) Two-color conventional immunofluorescence imaging of erythrocyte β-spectrin N- and C-terminal labeled with low- or high-adsorption secondary antibody; (c) Manders' correlation analysis and Spearman's rank correlation analysis for five different regions in Fig.4(a) and Fig.4(b); (d) STORM image corresponding to Fig.4(a); (e) local magnification in Fig.4(d); (f) (g) cross-correlation analysis and the nearest neighbor distance analysis for the data in the rectangular box in Fig.4(d); (h) STORM image corresponding to Fig.4(b); (i) local magnification in Fig.4(h); (j) (k) cross-correlation analysis and the nearest neighbor distance analysis for the data in the rectangular box in Fig.4 (h)

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进一步探究二抗物种特异性对双色STORM实际成像的影响。β-spectrin N端都是使用高吸附二抗（青色）。β-spectrin C端使用低吸附二抗情况下（洋红色），双色成像显示β-spectrin N端和C端存在部分共定位的情况，如图4（d）和图4（e）所示。而后对两个通道的点进行互相关分析，得到的互相关曲线的初始位置大于1，如图4（f）所示，最近距离分析在15 nm附近出现了峰值，如图4（g）所示，与发生信号串扰的模拟结果相似。β-spectrin C端也使用高吸附二抗，双色STORM成像结果表明β-spectrin N端和C端没有明显共定位，如图4（h）和图4（i）所示。其互相关系数在初始位置最小，约为0.4，说明β-spectrin N端和C端为互斥关系，且在约170 nm处达到相关性最大值，如图4（j）所示，最近距离分析在174 nm左右出现峰值，如图4（k）所示，与没有信号串扰的模拟结果相似，符合已有的红细胞骨架模型。这些结果表明低吸附二抗会导致信号串扰，造成双色STORM成像出现β-spectrin N端和C端共定位假象，因此二抗的物种特异性对双色STORM成像至关重要。

3.3　双色STORM成像中高吸附二抗揭示目标蛋白真实位置关系

CD47（Cluster of Differentiation 47）^［26］和程序性死亡配体1（Programmed Death-Ligand 1，PD-L1）^［27］是重要的免疫检查点蛋白。前者通过与信号调节蛋白α（SIRPα）结合，释放“别吃我”信号，抑制巨噬细胞的吞噬作用^［26］。后者通过与程序性死亡蛋白1（PD-1）结合，抑制T细胞的活性，使得T细胞不能有效地攻击被标记为“自体”的细胞^［27］。肿瘤细胞可通过过度表达CD47或PD-L1来逃避免疫系统的攻击，然而两种蛋白在膜上的位置关系以及是否存在相互作用，目前尚未清楚阐明。

为此，使用高吸附二抗对MDA-MB-231三阴乳腺癌细胞的CD47和PD-L1进行双色STORM成像，探究它们在膜上的准确位置关系。使用高吸附二抗标记CD47（洋红色）、高吸附二抗标记PD-L1（青色）进行双色STORM成像，结果显示CD47和PD-L1没有明显的共定位现象，如图5（a）和图5（b）所示。对两个通道的点进行互相关分析后，得到的互相关系数初始位置大小在1的附近，随后基本在1附近扰动，如图5（c）所示，也说明CD47和PD-L1在膜上的位置无共定位关系。作为对照，使用低吸附二抗标记CD47（洋红色）、高吸附二抗标记PD-L1（青色）进行双色STORM成像，明显观察到两个通道有部分点位置重叠，如图5（d）和图5（e）所示，互相关分析曲线也表明两个通道存在共定位，如图5（f）所示。这些结果再次验证二抗信号串扰导致双色STORM实验假象。

图 5. MDA-MB-231细胞中CD47和PD-L1的双色STORM成像。（a）高吸附二抗标记的双色STORM图像；（b）图5（a）的局部放大；（c）图5（a）矩形框区域的互相关分析；（d）低吸附二抗标记的双色STORM图像；（e）图5（d）的局部放大；（f）图5（d）矩形框区域的互相关分析

Fig. 5. Two-color STORM imaging of CD47 and PD-L1 in MDA-MB-231 cells. (a) Two-color STORM image obtained by high-adsorption secondary antibody labeling; (b) local magnification in Fig.5(a); (c) cross-correlation analysis for the data in the rectangular box in Fig.5(a); (d) two-color STORM image obtained by low-adsorption secondary antibody labeling; (e) local magnification in Fig.5(d); (f) cross-correlation analysis for the data in the rectangular box in Fig.5(d)

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4　结论

基于红细胞骨架模型中β-spectrin N端和C端的互斥位置关系，通过模拟和实验探讨了低吸附二抗对双色STORM成像结果的影响，从而建立了一种评估二抗物种特异性的超分辨成像标准解决方案。低吸附二抗进行双色STORM成像时会发生信号串扰，导致出现β-spectrin N端和C端共定位的实验假象，而高吸附二抗则可得到正确的位置关系。相较而言，抗体物种特异性的差别无法通过普通免疫荧光成像体现。进一步，使用高吸附二抗进行双色STORM成像，揭示出MDA-MB-231细胞免疫逃逸相关的两种膜蛋白CD47和PD-L1无共定位关系。综上，高物种特异性的二抗在STORM成像中尤为重要。本文提出的基于已知互斥位点进行双色STORM成像的检验方法将有助于判断二抗的物种特异性，提高结果的可靠性和稳定性，从而为利用双色STORM成像探究生物分子间的精准互作关系提供坚实的保障。