随机光学重建显微术（STORM）基于免疫荧光标记技术，具有原理易懂、光路简单、分辨率极高等特点，一直受到科研工作者的青睐，但分辨率的提升对抗体的特异性提出了更高的要求。相较一抗直接标记，“一抗+二抗”的间接标记法在实际应用中普适性更强。二抗相对一抗存在物种特异性的问题，生产时需要对其进行预吸附来提升物种特异性。为了探究二抗物种特异性对双色STORM成像的影响，基于经典的红细胞骨架模型中血影蛋白N端和C端的互斥位置关系，对二者使用高、低吸附二抗标记后分别进行双色STORM成像，对照模拟中有无信号串扰条件下的互相关分析结果，结果表明低吸附二抗会造成二者共定位的假象。进一步，分别通过高、低吸附二抗对MDA-MB-231乳腺癌细胞CD47和PD-L1两种膜蛋白进行双色STORM成像，结果揭示两种蛋白无共定位关系。本研究为二抗物种特异性的评估提供了一种基于红细胞骨架结构模型的超分辨成像新策略，助力双色STORM成像精准阐明蛋白分子互作关系。

21世纪初诞生的超分辨光学成像技术在生命科学研究中发挥着巨大作用,极大地增强了人们探索微纳尺度亚细胞结构的能力,然而这些成像技术往往耗时长,成本高。如今,许多研究者致力于基于深度学习的图像超分辨重建算法的研究中。利用自主搭建的随机光学重构超分辨显微镜获得细胞微管骨架超分辨图像,然后采用双线性插值降采样法处理得到低分辨率输入图集,再分别使用传统的三次样条插值法和增强型深度超分辨率神经网络进行学习训练,实现低分辨率图像的超分辨重建。结果表明:通过深度学习所重建的各种降采样的图像效果均优于采用传统插值法得到的图像效果,尤其是二倍降采样重建图像在主观和客观评价指标上可比拟实验获得的微管骨架超分辨图像。基于增强型深度超分辨率神经网络的细胞骨架图像超分辨重建有望提供一种简捷、有效和高性价比的成像方法,可应用于对细胞骨架超微结构的快速预测。

随机光学重构显微(STORM)的时间和空间分辨率相互制约,难以实现活细胞的超分辨成像,且超分辨图像的后处理分析与重构算法对图像质量也有非常重要的影响。基于此,针对高密度标记与高采样率所导致的单帧图像中光斑重叠及过多的背景噪声,提出一种用于单分子定位显微成像的新型噪声校正主成分分析(NC-PCA)方法,对单分子定位显微成像采集的图像进行预处理后再进行定位重构,提高了现有定位方法的定位精度,同时还实现了重叠分子的区分定位,从而提高了生物样品的标记密度,改善了超分辨成像的时间分辨率,可为活细胞单分子定位成像提供技术支持。

为了进一步认知复杂环境中的细胞生物学过程, 研究人员发展了各种各样的生物成像技术。在这些技术中, 生物荧光成像因简单的成像条件以及对生物样品的相容性而得到了广泛的发展。然而, 传统的荧光成像技术受到了光学衍射极限的限制, 无法分辨低于200 nm的空间结构, 阻碍了对亚细胞结构的生物学过程研究。超分辨荧光显微镜技术突破了传统光学衍射对成像分辨率的限制, 能够获取纳米尺度的细胞动态过程。除了对传统的宽场荧光显微镜框架的改进及升级改造之外, 目前典型的超分辨成像显微镜技术通常依赖于荧光探针材料的光物理性质。常用的荧光探针材料包括荧光蛋白、有机荧光分子和纳米荧光材料等。本文介绍了几种主流的超分辨荧光显微成像技术并总结了已经成功应用到超分辨生物荧光成像中的荧光探针材料的应用进展。

动力蛋白、微管蛋白以及染色体在卵母细胞减数分裂过程中起着重要作用, 但目前传统荧光成像方法受到衍射极限的限制, 分辨率较低, 无法达到卵母细胞减数分裂对成像的要求。首先构建了卵母细胞体外正常成熟体系和原钒酸钠(SOV)作用下的异常成熟体系, 然后基于共聚焦显微技术和随机光学重建显微技术(STORM)两种荧光成像方法, 研究卵母细胞减数分裂过程中动力蛋白和微管蛋白的定位以及染色体的形态与结构。荧光显微成像结果表明：在正常成熟体系中, 动力蛋白分布、微管蛋白形成的纺锤体以及染色体的形态与结构能反映卵母细胞发育的不同阶段；在SOV作用下, 纺锤体结构异常率增加, 出现桶状、细长、团缩、杂乱、梨状、多极等典型异常纺锤体结构, 染色体结构异常率也相应增加。 STORM结果更清晰地展现了纺锤体结构信息, 三维STORM结果揭示了异常纺锤体的紊乱情况, 该方法为卵母细胞减数分裂过程研究提供了精度更高的成像手段。

Optical microscopy promises researchers to see most tiny substances directly. However, the resolution of conventional microscopy is restricted by the diffraction limit. This makes it a challenge to observe subcellular processes happened in nanoscale. The development of superresolution microscopy provides a solution to this challenge. Here, we briefly review several commonly used super-resolution techniques, explicating their basic principles and applications in biological science, especially in neuroscience. In addition, characteristics and limitations of each technique are compared to provide a guidance for biologists to choose the most suitable tool.

在光学显微成像领域, 涌现出一批可以突破衍射极限的超分辨显微成像技术, 极大地增强了人们研究亚细胞结构的能力。基于单分子定位技术的随机光学重构显微术(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM)具有易懂的成像原理、简单的工作方式以及超高的分辨率等特点, 受到越来越多的研究者青睐。首先, 介绍了单分子定位技术的原理, 讨论了STORM光路的搭建, 阐述了二维和三维STORM超分辨显微成像原理。其次, 探讨了多色STORM以及STORM与电镜关联成像现状。最后介绍了STORM技术现阶段的应用进展。

光学显微成像技术在生命科学、生物医学、临床医学诊断和材料科学等领域有着非常广泛的应用。但由于光学衍射极限的存在, 传统光学显微镜无法观察到纳米尺度的物质及生命活动, 极大地限制科学研究和医学的发展。近年来, 随着突破光学衍射极限的超分辨成像技术的不断发展, 显微成像分辨率得到不同程度的提高。目前在基于不同原理的各种超高分辨率显微镜中, 随机光学重构显微镜 (STORM) 分辨率最高, 可达几十纳米, 真正实现了单分子水平检测。着重介绍了STORM超分辨显微成像技术的原理、实验方法及其应用。

多色成像作为超分辨成像技术的重要延伸, 极大地增强了人们研究亚细胞结构定位与交互关系的能力, 从而有助于研究者深入理解细胞内复杂的生命现象与过程。基于单分子定位超分辨显微成像术(SMLM)工作原理的特殊性, 已实现了激发依赖、激活依赖、分光依赖等数种有特点的多色成像方法。介绍6种主要的多色单分子定位超分辨显微成像技术, 从分色能力、光谱窜扰、数据采集效率等角度分析了各方法的优缺点, 并讨论了与多色成像相关的细胞固定方法, 帮助研究人员根据自身实验需求选择合适可靠的多色成像手段研究相应的科学问题。