同型半胱氨酸的太赫兹特征吸收光谱分析 
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1 引言
同型半胱氨酸(C4H9NO2S)是一种含硫氨基酸,对人体有害,其在人体内的含量过多时会成为心血管疾病、冠心病、糖尿病及并发症、老年痴呆等疾病的致病因子[1-3]。目前,医学上对同型半胱氨酸的检测方法主要有高效液相色谱检测法(HPLC)、荧光极化免疫法(FPIA)和酶联免疫吸附法(ELISA)3种。这3种方法都存在检测耗时、成本昂贵等缺点。
太赫兹(THz)精密光谱技术是一种有效的物质鉴定和分析方法[4-8]。THz在生物检测中的反射光谱、透射光谱携带着物质本身丰富的物理和化学信息,同时,低电离能的独特优势,使得THz在生物检测中不会破坏生物细胞,从而达到无损检测的效果,所以THz光谱在探索物质结构方面具有重要价值。由于许多有机分子的振动和转动频率都在THz的有效波段内,可以通过检测THz特征吸收光谱(也叫指纹谱)进行物质识别[9-11]。针对同型半胱氨酸,本文首先利用密度泛函理论(DFT)计算并分析THz吸收光谱,然后基于THz时域光谱检测同型半胱氨酸的吸收光谱随浓度的变化。本研究为人血浆/尿液中同型半胱氨酸含量的快速检测提供了参考,对临床医学具有重要意义。
2 理论模型及指纹谱分析
THz光谱特征吸收峰是由辐照后的THz波与物质分子中原子/官能团的振动/转动的共振吸收产生的[12]。对于分子的振动/转动模式分析,目前较多使用的是DFT,它是一种研究多电子体系电子结构的量子力学方法,其广泛应用在物理和化学领域,特别适合用来研究分子和凝聚态物质的性质,是凝聚态物理计算材料学和计算化学领域最常用的方法之一。Gaussian-09包是目前计算化学领域最流行、使用范围最广的综合性量子化学计算程序,它是基于量子力学而开发的,致力于把量子力学理论应用于实际问题,它可以通过一些基本命令验证和预测目标体系几乎所有的性质。
本文使用DFT Gaussian-09程序包中的B3LYP杂化泛函功能和3-21G基集功能对同型半胱氨酸进行计算模拟,得到的分子结构模型如
图 2. DFT计算得到的同型半胱氨酸THz特征吸收谱
Fig. 2. THz characteristic absorption spectrum of homocysteine calculated by DFT
在
3 实验过程及数据分析
在证明同型半胱氨酸的特征吸收谱位于可检测的THz频段范围内之后,应用标准的THz时域光谱系统(THz-TDS)来进行实验测试和验证。THz-TDS是基于相干探测技术的THz产生与探测系统,能够同时获得THz脉冲的振幅信息和相位信息,再通过对时间波形进行傅里叶变换,就能直接得到样品的吸收系数、折射率、透射率等光学参数。THz时域光谱具有高探测信噪比、较宽的探测带宽、高探测灵敏度、可应用于多种样品探测、可实现无损检测等特点[13-18]。实验所用装置是商用快速扫描系统(EKSPLA),音圈级单次扫描时间为0.09 s。系统测量信号的有效带宽为0.1~3.0 THz,频谱分辨率优于15 GHz,信噪比
实验所用同型半胱氨酸纯品(纯度≥95%,CAS∶454-29-5)在Sigma网站购买。将每个样品与聚乙烯(PE)粉末(纯度>99%,研磨后粒径小于50 μm)混合均匀,得到不同浓度的样品,然后用29.4 kN的力将其压成1 mm厚的片剂[19-20],且质量损失严格控制在1%以下。同型半胱氨酸浓度(
式中,
实验前,为克服血液/尿液中水对THz波的强吸收,又考虑到血液/尿液中同型半胱氨酸含量极低,本项工作中首次提出针对THz光谱技术的浓缩富集再烘干含待测物质的样品的处理方法,即选择恰当尺寸的分子薄膜和合适的烘干时间来消除水的干扰,提升检测结果的准确度。以尿液为例, 正常人体内2 L尿液中含有约2.5 mg同型半胱氨酸, 通过过滤、浓缩与烘干处理后,将其与120 mg PE混合后可得到浓度为0.14 mol/L的样品,因此0.14 mol/L可作为判定实际人体血液/尿液中同型半胱氨酸含量是否超过正常值的标准。
实验以120 mg PE作为背景,采集背景参考信号,然后测试30 mg同型半胱氨酸纯品与120 mg PE混合后得到的浓度为1.68 mol/L的样品。将所制备的片剂放入THz-TDS进行检测,得到样品的THz时域谱和频域谱图,如
图 3. 1.68 mol/L同型半胱氨酸的谱图表征。(a)时域谱;(b)频域谱;(c)吸收图
Fig. 3. Spectra characterization of 1.68 mol/L homocysteine. (a) Time domain spectra; (b) frequency domain spectra; (c) absorption spectrum
为获得样品的时域谱,先去除样品时域信号的反射峰,得到1578个样品点,其余用0填充,使总点数仍为2048;傅里叶变换得到频域谱后,再计算样品的相对吸收系数谱线。采用的计算公式为
式中,
明确同型半胱氨酸的THz特征吸收峰后,使用THz-TDS测试不同浓度同型半胱氨酸的吸收光谱,以获得浓度与THz光谱的对应关系,用于医学同型半胱氨酸浓度的快速准确鉴别。具体实验中,将不同质量的同型半胱氨酸纯品与120 mg PE混合,得到浓度分别为0.14,0.28,0.42,0.56,0.67,0.84,0.96,1.12,1.34,1.68 mol/L的样品。这些样品分别对应于人体血液/尿液中含有9.5,19.0,28.5,38.0,45.5,57.0,65.1,76.0,90.9,114.0 μmol/L的同型半胱氨酸,这些浓度涵盖了疾病发展程度从正常到严重所对应的人体血液/尿液中同型半胱氨酸含量的区间范围,测得这些样品的吸收光谱如
图 4. 不同浓度同型半胱氨酸溶液的THz吸收光谱
Fig. 4. THz absorption spectra of homocysteine solutions with different concentrations
为准确地定量分析同型半胱氨酸,分别提取不同浓度同型半胱氨酸样品在1.29 THz与1.93 THz吸收峰处的吸光度,根据比尔-朗伯定律,对数据进行线性拟合,对应的线性拟合函数表达式分别为
式中,
图 5. 不同浓度同型半胱氨酸样品在1.29 THz与1.93 THz处吸收系数与浓度的线性关系
Fig. 5. Linear relationship between absorption coefficient and concentration of homocysteine with different concentrations at 1.29 THz and 1.93 THz
由
4 结论
通过理论计算得到同型半胱氨酸的太赫兹振动与转动分子模型、太赫兹吸收光谱的理论峰值,制备不同浓度的同型半胱氨酸溶液进行测试,证实了采用太赫兹吸收光谱有效识别同型半胱氨酸浓度的可行性,再结合比尔-朗伯定律得到了不同浓度的同型半胱氨酸太赫兹吸收峰值对应的线性拟合函数,使得检测流程更加简洁,这对临床医学上同型半胱氨酸相关疾病的快速高精度检测具有重要参考意义。后期通过对数据库标准样本的吸收谱进行更换,还可以实现人体血液/尿液内其他氨基酸的定量分析,这同样对临床医学与其他氨基酸相关疾病的快速高精度检测具有重要参考意义。
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王莹莹, 汪丽平, 李恬, 严俊, 彭滟. 同型半胱氨酸的太赫兹特征吸收光谱分析[J]. 光学学报, 2019, 39(10): 1030003. Yingying Wang, Liping Wang, Tian Li, Jun Yan, Yan Peng. Terahertz Characteristic Absorption Spectrometric Analysis of Homocysteine[J]. Acta Optica Sinica, 2019, 39(10): 1030003.
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