1 引言

白血病是发病率较高且严重危害人类健康的血液系统恶性肿瘤。光动力疗法(PDT)是一种利用特定波长的光照射光敏药物,产生单线态氧或氧自由基,从而造成靶组织或靶细胞损伤的新型治疗方法^[1-2]。PDT具有选择性杀伤肿瘤细胞、抗瘤谱广、可与其他治疗方法联合使用等诸多优点^[3-5]。在光动力治疗中,光敏剂作为能量载体和反应桥梁对治疗效果起着决定性的作用^[6-7],所以对光敏剂性能的改善及新型光敏剂的构建成为当前研究的热点。二氧化钛(TiO₂)作为一种光催化材料,具有光催化活性较高、生物相容性较好和化学性质稳定等一系列优点^[8],这些优点使其应用于PDT中成为可能。但由于TiO₂具有较宽的带隙宽度,从而导致其对可见光的响应度较低,使其在PDT应用中受到一定的限制^[9]。

量子点(QDs)因其独特的性质而被广泛应用于生物成像和探针标记^[10-11]。量子尺寸效应优异决定了量子点激发光波长范围宽、发射光谱宽度窄的优点。研究发现,TiO₂通过量子点改性可将其吸收谱拓展至可见光区,达到可见光响应的目的,提高了光催化效率^[12-13]。实验研究表明,CdSe与TiO₂复合可以有效提高TiO₂对可见光的利用效率,光催化性能明显改善^[14]。本课题组前期研究也发现,CdSe-TiO₂纳米颗粒对人早幼粒细胞白血病的细胞系(HL60细胞)有较好的灭活效果^[15]。

在PDT治疗中,光敏剂的靶向性能越来越引起研究者的重视。叶酸受体(FR)对叶酸(叶酸)及其类似物具有灵敏度高、特异性强的优点^[16-17]。它主要包括FR-α及FR-β两种亚型,研究发现^[18-19]叶酸受体在不同亚型的白血病细胞中,有68%的FR-β受体发生过度表达的现象,而在正常人血细胞中的表达极少。本课题组相关的研究表明,通过叶酸修饰增强了HL60细胞对硫掺杂TiO₂(S-TiO₂)纳米颗粒的吸收^[20]。

本文采用水解沉积法制备可见光响应的CdSe-TiO₂纳米颗粒,用叶酸对其表面进行修饰制得FA-CdSe-TiO₂,探究了叶酸修饰前后及不同比例的叶酸修饰下对HL60细胞的光动力灭活效果,从而证明了FA-CdSe-TiO₂具有作为光敏剂的重要特性。

2 材料与方法

2.1 细胞株

HL60细胞由中山大学实验动物中心细胞库提供。

2.2 试剂和仪器

叶酸(上海Sigma Aldrich)、硒粉(Se,>99.99%)、无水亚硫酸钠(分析纯)、钛酸丁酯(C₁₆H₃₆O₄Ti,分析纯)、无水乙醇(C₂H₆O,分析纯)、氯化镉水合物(CdCl₂·H₂O,>99.5%)、巯基乙酸(C₂H₄O₂S,分析纯)、碳酸氢钠(中国Daomao)、氢氧化钠(天津致远)、盐酸(天津致远)、pH试纸、完全RPMI-1640培养基(美国Gibco)、活性氧检测试剂盒(北京普利来)、CCK-8试剂(日本同仁化学研究所)、台盼蓝。

本研究所用仪器如下:UV-3100型紫外-可见分光光度计,WFY-28型荧光分光光度计(天津拓普公司),傅里叶变换红外光谱(FTIR)仪(型号:Nicolet 6700),JEM-2100HR透射电子显微镜(TEM,日本Jeol公司),Countess TM型自动细胞计数仪(美国Invitrogen),PDT反应室(自行设计),410 nm LED光源(自行设计),Bio-Rad imark酶标仪(美国伯乐),SW-sCJ型洁净工作台(苏州安泰),超微振荡器(姜堰新康),HH·CP-TW(80 L)二氧化碳培养箱(上海一恒科技),细胞计数板及96孔板等其他常规器皿。

2.3 实验方法

2.3.1 FA-CdSe-TiO₂纳米复合颗粒的制备

CdSe是以巯基乙酸为稳定剂,利用水相法合成的水溶性量子点。

1) CdSe-TiO₂纳米颗粒的制备

采用水解沉积法。称取0.13196 g CdSe粉末,加入30 mL无水乙醇,超声震荡1 h得分散体系A。再量取1.761 mL钛酸丁酯,边搅拌边逐滴加入到A中,搅拌15 min得分散体系B。将体积比1∶5的水和无水乙醇混合液10 mL,边搅拌边逐滴加入B中,继续搅拌1 h。离心分离沉淀物,分别用蒸馏水和无水乙醇清洗两遍,室温下风干。用马弗炉500 ℃焙烧4 h,碾磨30 min,过滤、杀菌制得样品。

2) 叶酸表面修饰

将840 mg碳酸氢钠溶入100 mL的去离子水中,量取40 mL碳酸氢钠溶液并使用氢氧化钠和盐酸将其pH值调为5.5。将适量叶酸加入所制得的碳酸溶液中,置于磁力搅拌器上搅拌。取适量CdSe-TiO₂纳米颗粒样品加入5 mL去离子水中进行超声分散。将所配制的CdSe-TiO₂纳米颗粒悬液在超声的环境下逐滴加入到叶酸溶液中,将混合溶液避光处理,在室温下持续搅拌24 h。最后将制得的FA-CdSe-TiO₂纳米颗粒使用饱和碳酸氢钠溶液和去离子水各清洗2遍。

2.3.2 细胞培养与计数

将HL60细胞置于完全RPMI-1640培养基中,把整个培养基放入37 ℃、5% CO₂、95%(均为体积分数)空气的二氧化碳培养箱中培养。取处于对数生长期的细胞进行实验。将打散的细胞液与台盼蓝按1∶1的比例混合,将混合液移至细胞计数板上,使用自动细胞计数仪计数。

2.3.3 细胞实验

根据探究目的,事先在96孔培养板上规划好实验,实验分为光照板和遮光板,每块板分别设置实验组和调零组,同一参数设置三个重复孔以减小误差。取对数生长期细胞浓度为4×10⁵ mL^-1的HL60细胞接种到96孔板中,实验组中每个孔接种100 μL的HL60细胞,紧接着在实验组中分别加入终值质量浓度为10,20,30,50 μg/mL的CdSe-TiO₂和不同叶酸比例的FA-CdSe-TiO₂溶液各100 μL;在调零组中,只加入200 μL的血清含量为10%的RPMI-1640培养液,将板放在超微振荡器上振荡,使药物和细胞混合均匀,用酒精擦拭96孔板,将其置于培养箱中培养。其中,光照板细胞在培养12 h后,置于PDT辐照室接受不同光照剂量的光照(光功率为5 W/cm²);遮光板则避光处理,连续培养12 h。所有孔板每孔加入20 μL的CCK-8试剂,置于超微振荡器振荡,混合均匀后置于培养箱中继续培养4 h,最后使用美国Bio-Rad伯乐imark酶标仪,以450 nm为测量波长,630 nm为参考波长,检测上述实验组和调零组细胞活性的吸光度。

2.3.4 细胞内活性氧检测

采用荧光探针标记技术测试细胞内活性氧水平^[21]。取细胞浓度为4×10⁵ mL^-1的HL60细胞,加入终值质量浓度为20 μg/mL的纳米颗粒,在暗室条件下共同孵育12 h。配制物质的量浓度为10 μmol/L的DCFHDA培养液,加入上述细胞液中孵育20 min。孵育完成后,取出细胞,用磷酸盐缓冲(PBS)溶液将细胞清洗2次,将其置于光动力反应室中光照1 h。光照后,使用荧光分光光度计,在488 nm激发波长下进行细胞内活性氧探针的荧光检测。

2.3.5 细胞活性检测

CCK-8(Cell Counting Kit-8)法具有操作简单方便、灵敏度高、重复性好的优点^[22-23]。故本实验采用CCK-8法,以450 nm为测量波长,630 nm为参考波长进行细胞活性检测,以提高实验的准确度。

2.3.6 光照系统

使用本课题组自主发明的基于LED阵列的光动力反应装置(专利号:201210244215.9)。它由均匀的面光源LED阵列、光电检测装置、单片机以及升降台(载物台)等结构组成。本装置可通过调节载物台与光源的距离,实现光功率密度可调的特性。

2.3.7 数据分析

实验数据采用Origin、SPSS 11.5软件进行处理,实验数据均采用“均值±标准差”的方式进行表示。

3 实验结果分析与讨论

3.1 叶酸修饰的CdSe-TiO2纳米复合颗粒的表征

3.1.1 TEM成像分析

如图1(a)、(c)所示为CdSe-TiO₂样品的TEM图像,可以观察到实验制备的CdSe-TiO₂纳米颗粒呈球状或类方形,具有一定的分散性,尺寸在30 nm左右;图1(b)、(d)为FA-CdSe-TiO₂样品的TEM图,对比图(a)、(c)可以发现,叶酸修饰后纳米颗粒的分散性没有显著改变,在纳米颗粒表面可以观察到一层有机包覆膜[图1(d)箭头所指],证明了叶酸与CdSe-TiO₂成功结合,图(d)中显示的叶酸修饰后纳米颗粒粒径约为40 nm。研究表明粒径在100 nm以下的颗粒均能满足进入细胞的条件,因此本实验所制备的纳米颗粒符合光敏剂的尺寸要求。

3.1.2 能谱仪(EDS)结果分析

如图2所示为FA-CdSe-TiO₂纳米颗粒的EDS分析结果,图中所出现的Se、Cd、Ti和O的元素峰表明,本实验已成功制备出CdSe-TiO₂复合纳米颗粒。EDS测试结果显示样品含有大量的C元素,这可能是因为叶酸表面修饰的原因。结果还显示有铜元素峰,这可能是由于在进行EDS分析时使用了铜网装载样品^[24]。

3.1.4 FTIR分析

如图3所示,在叶酸的FTIR结果(曲线b)中3320,3540 cm^-1的吸收峰,是由叶酸分子中羟基(—OH)和氨基(NH—)的振动所引起的;CdSe-TiO₂纳米颗粒的FTIR(曲线c)中,位于807 cm^-1吸收峰对应于O—Ti—O键的振动,位于1645,3313 cm^-1处的吸收峰则是由锐钛矿表面的羟基

图 1. (a)、(b) CdSe-TiO2样品的TEM图像和(c)、(d) FA-CdSe-TiO2样品的TEM图像

Fig. 1. (a),(b) TEM images of CdSe-TiO2 sample and (c),(d) TEM images of FA-CdSe-TiO2 sample

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图 2. FA-CdSe-TiO2样品的EDS能谱

Fig. 2. EDS energy spectrum of FA-CdSe-TiO2 sample

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(—OH)振动引起。在FA-CdSe-TiO₂的FTIR(曲线a)中可以发现,叶酸修饰CdSe-TiO₂后,位于1645,3313 cm^-1附近的吸收峰消失或减弱,而在1481 cm^-1处出现类似于羧酸盐(—COOM)的吸收峰,在1689 cm^-1处出现叶酸的喋啶环伸缩振动的特征峰,以及在3319,3334 cm^-1附近出现对应叶酸分子中氨基(NH—)振动的吸收峰。综合以上结果分析可知,叶酸分子与CdSe-TiO₂表面的羟基以酯化反应的方式相结合形成FA-CdSe-TiO₂。

图 3. (a) FA-CdSe-TiO2样品的FTIR;(b)叶酸的FTIR;(c) CdSe-TiO2样品的傅里叶红外光谱

Fig. 3. (a) FTIR of FA-CdSe-TiO2 sample; (b) FTIR of FA; (c) FTIR of CdSe-TiO2 sample

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3.1.5 紫外-可见光吸收光谱分析

如图4(a)所示,可以观察到TiO₂的吸收谱主要位于387.5 nm以下,这也是由其具有较宽的带隙宽度(3.2 eV)所致。相比与TiO₂的吸收光谱,CdSe-TiO₂和FA-CdSe-TiO₂纳米颗粒的吸收光谱均不同程度的红移至可见光区,且在410 nm处FA-CdSe-TiO₂相较于CdSe-TiO₂的吸收强度略有增加,这说明,CdSe和TiO₂的复合有效地增强了TiO₂对可见光的吸收,经适量叶酸分子的修饰,仍可以保持纳米颗粒对可见光的有效吸收。

图4(b)为本实验采用的光动力辐照室LED光源的发射光谱,其发射峰位于410.23 nm处,与FA-CdSe-TiO₂、CdSe-TiO₂的吸收谱有较好的重叠,能够满足对该纳米颗粒可见光激发的实验要求。

3.2 不同浓度下CdSe-TiO2和不同叶酸比例的FA-CdSe-TiO2纳米粒子对HL60细胞的暗室毒性

CdSe-TiO₂和不同叶酸比例修饰的FA-CdSe-TiO₂纳米颗粒在暗室条件下对HL60细胞的活性的影响如图5所示。从图中可以发现,暗室条件下,当样品质量浓度小于20 μg/mL时,CdSe-TiO₂和叶酸修饰比例分别为0.2,0.4,1.0,2.0的FA-CdSe-TiO₂样品的样品与细胞共育12 h后,细胞相对存活

图 4. (a)纳米颗粒的紫外-可见吸收光谱;(b)光动力试验箱LED阵列发射光谱

Fig. 4. (a) Ultraviolet-visiable absorption spectrum of nanoparticles; (b) emission spectrum of LED array in PDT test box

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率大约保持在80%以上,当药物浓度逐渐增大时,细胞相对存活率逐渐降低。另外,在叶酸比例小于100%时,随着叶酸比例的增加,细胞的相对存活率随之降低,这表明叶酸分子对HL60细胞的靶向作用,提高了HL60细胞对FA-CdSe-TiO₂纳米颗粒的摄取效率。当叶酸修饰比例增加到2.0时,相对于较低比例修饰的样品,暗室条件下细胞相对存活率反而增加,这可能是由于叶酸大比例的增加,降低了纳米颗粒中CdSe的比例,使得药物本身的毒性降低,表明叶酸的修饰不会引起新的细胞毒性,可能还能在一定程度上减缓纳米颗粒的毒性。

图 5. 不同浓度下CdSe-TiO2和FA-CdSe-TiO2 (不同叶酸比例)纳米粒子作用下的HL60细胞在暗室条件下的细胞存活率

Fig. 5. Viability of HL60 cells treated with CdSe-TiO2 and FA-CdSe-TiO2 (with different FA ratios) nanoparticles with different concentrations under darkroom conditions

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3.3 不同光照剂量下CdSe-TiO2和不同叶酸比例的FA-CdSe-TiO2纳米粒子PDT效率

图6为CdSe-TiO₂和不同叶酸比例的FA-CdSe-TiO₂纳米颗粒在不同光照强度下对HL60细胞的PDT灭活效率。根据纳米颗粒对HL60细胞暗室毒性的结果,选取纳米颗粒质量浓度为20 μg/mL,分别按照6,12,18 J/cm²的光剂量进行光辐照。可以发现,光辐照后细胞的相对存活率大幅降低。从图中看出,与CdSe-TiO₂相比,FA-CdSe-TiO₂对HL60细胞的PDT灭活效率明显提高。随着光照强度的增加,不同样品的PDT灭活效率均有所提高。其中当叶酸修饰比例为1.0、光照强度为18 J/cm²时,PDT灭活效率最高,达84%。同时发现,在叶酸比例总体小于1.0时,FA-CdSe-TiO₂的灭活效率随着叶酸比例的增加而增加,而当叶酸修饰比例增加到2.0时,PDT灭活效率出现显著降低,这可能是由于过量的叶酸表面修饰阻碍了光源对CdSe-TiO₂的激发。

图 6. 不同光照剂量下CdSe-TiO2和不同叶酸比例的FA-CdSe-TiO2对HL60细胞的PDT效率

Fig. 6. PDT efficiency of CdSe-TiO2 and FA-CdSe-TiO2 modified with different FA ratios on HL60 cells at different light intensities

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3.4 活性氧水平分析

在PDT中,光敏剂在光照激发后,将能量传递给细胞内的氧分子,产生大量氧化性极强的活性氧,导致细胞膜或细胞器被破坏,从而杀伤细胞^[25-26]。本实验采用荧光探针标记技术,通过测得的荧光光谱分析了PDT过程中,CdSe-TiO₂和叶酸比例为100%的FA-CdSe-TiO₂作用于HL60细胞后,细胞内产生的活性氧水平。结果如图7所示,FA-CdSe-TiO₂对应的细胞组细胞内活性氧的水平高于CdSe-TiO₂对应的细胞组。该活性氧水平测试结果与前述PDT效率实验结果一致,说明通过叶酸修饰可以有效提高HL60细胞对纳米颗粒的摄取率,从而增强对HL60细胞的光动力灭活效率。

图 7. PDT作用后HL60细胞中活性氧探针荧光光谱(λex=488 nm)

Fig. 7. Fluorescence spectra of reactive oxygen species probe in HL60 cells after PDT (λex =488 nm)

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3.5 PDT作用前后HL60细胞超微结构观察

通过扫描电镜法观察PDT作用前后HL60细胞的超微结构,得到如图8所示结果。图8(a)为正

常HL60细胞图,可以看到,HL60细胞直径约为8 μm,细胞结构完整、轮廓清晰、且有绒毛结构。图8(b)为CdSe-TiO₂介导PDT作用后HL60细胞的超微结构图,可以看出,CdSe-TiO₂和HL60细胞共育并光照后,细胞结构被破坏,细胞膜表面产生一定程度的破裂和小孔,细胞不完整,有裂解趋势;分析认为,CdSe-TiO₂主要聚集在细胞膜表面,经光照激发,产生活性氧自由基(ROS),致使细胞膜表面破坏,最终导致细胞裂解坏死。图8(c)、(d)分别为FA-CdSe-TiO₂与HL60细胞共育并光照后的多个细胞图和单个细胞图,从图8(d)可以看出,细胞结构被破坏严重,细胞膜出现严重破裂和缺陷,细胞器组织也出现一定程度破坏;分析认为通过内吞作用进入细胞的FA-CdSe-TiO₂纳米颗粒和聚集在细胞膜表面的纳米颗粒,在光照激发后产生大量ROS,ROS与细胞器及细胞膜发生氧化反应,导致细胞器和细胞膜被破坏,从而使HL60细胞坏死。

图 8. (a)正常HL60细胞和(b)、(c)、(d) PDT处理后HL60细胞的超微结构

Fig. 8. Ultrastructural morphology of (a) untreated HL60 cell and (b), (c), (d) HL60 cells after PDT

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4 结论

通过水解沉积法和表面修饰的方法,分别制备得到CdSe-TiO₂和FA-CdSe-TiO₂纳米颗粒,采用TEM、EDS、FTIR和紫外可见吸收光谱对纳米颗粒结构和光学性质进行了研究,结果表明,通过CdSe与TiO₂的复合及叶酸的表面修饰成功将TiO₂的吸收光拓展到可见光区;叶酸分子与CdSe-TiO₂表面的羟基以酯化反应的方式相结合,纳米颗粒粒径在30~50 nm左右,满足光动力细胞实验的要求。细胞暗室毒性实验发现,在药物质量浓度低于20 μg/mL时,其暗室毒性较小,细胞存活率在80%左右;不同光照强度下,经过适量比例的叶酸表面修饰,有效提高了CdSe-TiO₂对HL60细胞的PDT灭活效率,其中当叶酸修饰比例为1.0时,灭活效率最高,达84%。活性氧分析发现,FA-CdSe-TiO₂对应的细胞组活性氧水平相较于CdSe-TiO₂更高,与PDT灭活效率的结果一致。对PDT作用前后HL60细胞的超微结构观察进一步表明,叶酸的表面修饰,提高了细胞对纳米颗粒的摄取效率,从而提高了对HL60细胞的光催化灭活效率。

综合以上分析,本实验研究制备的FA-CdSe-TiO₂,有良好的生物相容性和光催化灭活效果,具有作为光动力治疗白血病细胞光敏剂的重要特征。FA-CdSe-TiO₂纳米颗粒对血液正常细胞的影响研究,将是下一步的工作。