1 引言

光片荧光显微镜(LSFM)以其较强的切片能力、快速采集和三维(3D)无损成像等优势,在细胞生物学^[1-2]、生物物理学^[3-4]和神经科学^[5-6]等方面得到越来越广泛的应用。LSFM的两个物镜垂直放置,仅探测物镜焦平面附近的样品被照明进而辐射荧光信号,从而实现切片效果,极大地减少离焦信号并减轻光毒性和光漂白性^[7-9]。此外,由于整个探测物镜焦平面的荧光信号被一次性采集,因此LSFM是一种宽场成像的手段,能够极大地提高图像采集的速度^[10-12]。为了满足亚细胞成像的需求,需要采用高数值孔径(NA)的物镜以激发出超薄的光片,进而实现数百纳米的空间分辨率^[13-14]。然而,对于这种装置而言,机械偏移是一个很严峻的问题,尤其是在长时间成像进程中,机械偏移会持续恶化图像质量,甚至使图像脱离视野。

当前对于LSFM稳定性的研究不多,机械偏移的补偿精度也有限,普适性不高。因此本文提出了一种利用4f(f为焦距)系统和电子耦合器件(CCD)相机来监测机械偏移、使用纳米平移台进行反馈调节的方法提高系统的长时间成像稳定性。首先CCD对从盖玻片表面反射的光片进行成像,并对采集的图像进行分析,进而监测样品的位置,随后将样品的位置传递给纳米平移台,通过纳米平移台的反馈调节使样品始终位于光片的束腰位置,以达到最好的成像质量。此外,可以通过调节4f系统的放大倍率来改变CCD相机对于机械偏移的响应精度。

2 基本原理

2.1 计算样品的位置

在LSFM中,滤光片通常被放置在探测光路中以过滤除荧光之外的其他光信号^[15-16]。然而,在本实验中,利用激发光作为样品位置的参考。如图1所示,激发光片经盖玻片反射后入射到探测物镜中,随后反射光片经4f系统放大后在CCD中成像。对反射光片进行强度分析得出反射光片在垂直方向的偏移量ΔS_y ,则样品在z轴方向的偏移量为

ΔSz=ΔSya2MN,(1)

式中:a为CCD相机的单个像素尺寸;M为探测光路的放大倍数;N为4f系统的放大率。通过对反射光片进行强度分析得出,最小能被识别的偏移量为1。当ΔS_z=1时,所对应的即为最小能辨别的机械偏移量。根据(1)式,提升反馈系统对机械偏移监测精度的方式有三种:增大M、增大N以及减小a。考虑到经济效益和实现难易程度,选择增大N来实现目标最具可行性。图1 右侧是N取不同数值时,CCD相机中采集到的反射光片图像。

图 1. 基于4f系统和CCD相机的长时间成像稳定装置图

Fig. 1. Schematic of long time stabilization system with 4f optical setup and CCD camera

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2.2 实验装置

图2是自主搭建的光片荧光显微镜装置图。M1~M5是反射镜;L1~L10是消色差透镜,其对应的焦距分别为25,50,100,150,50,75,50,100,30,50 mm。从488 nm固体激光器中出射的光束先经L1和L2扩束,再经L3和L4放大至直径约为2.1 mm,随后射入柱透镜CL(焦距f=50 mm)中生成光片。振镜GM(GVS001,Thorlabs,美国)被放置在柱透镜的焦平面上,并与激发物镜OBJ1(N40X-NIR,Nikon,日本)的后焦面共轭,光片经GM反射后再经L5和L6射入激发物镜中,并在样品处生成600 nm厚的光片。 探测物镜OBJ2(N40X-NIR, Nikon,日本)安装在压电陶瓷PZE(P-726.1CD,PI,德国)上,被用来接收样品处的光信号,这些光信号经过套筒透镜TL(焦距f=200 mm)后被长波通二向色镜DM(DMLP505R,Thorlab,美国)分成荧光信号和反射光片两部分,荧光信号经过L7和L8后在sCMOS (scientific Complementary Metal-Oxide-Semiconductor)相机(C13440,Hamamatsu,日本)中成像,反射光片则经由L9和L10后在CCD相机(DCC1645C,Thorlabs,美国)中成像。F0是由F9和F10组成的4f系统,实验中保持L9的位置不变,通过改变L10 的焦距来调节N值。样品放置在纳米平移台NS(MAX341M,Thorlabs,美国)上,其坐标轴方位在图的右下角。样品的3D图像可通过图中左下角所显示的物镜扫描模式或者样品扫描模式来实现。对于物镜扫描模式,通过控制GM和 PZE进行同步扫描,从而实现3D图像采集,其中GM带动激发光片沿着轴向扫描,PZE带动探测物镜沿着轴向同步扫描,各自的扫描方向在图中用黑色箭头标出;对于样品扫描模式,通过控制NS使样品沿着图中的箭头方向即可实现3D图像采集。

图 2. LSFM的实验装置图

Fig. 2. Schematic of LSFM experimental setup

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2.3 样品位置的修正

系统的控制信号如图3所示,最上方是触发信号,采取上升沿触发的方式;中间是相机的曝光控制信号;最下方是GM和PZE/NS的控制信号。假定GM从初始位置出发再回到初始位置的整个过程为一个完整的扫描周期,其中GM每次运动后所停留的时间称为一个子阶梯。一个共同的触发信号使相机、GM和PZE同时开始运动,其中GM和PZE每个子阶梯长度与相机的一次曝光和数据读出的总长度保持一致。在相机每次读出数据的同时确认样品当前位置并调节纳米平移台,使样品处于光片束腰处,然后重复上述过程。实验中相机可设置的曝光时间为1 ms到10 s,因此扫描周期中每个子阶梯的长度可根据曝光时间和读取时间以及反馈调节时间来确定。此外,也可以用纳米平移台NS代替GM和PZE来实现3D成像,其控制信号与GM和PZE保持一致。

图 3. sCMOS相机以及GM和PZE/NS的控制信号

Fig. 3. Control signal sequences for sCMOS camera as well as GM and PZE/NS

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实验装置的反馈控制流程如图4所示。打开激光器并调节纳米平移台,使样品处于光片的束腰位置,此时样品成像最优。对于快速3D成像,子阶梯的长度很短,因此可忽略相机曝光过程中的机械漂移,将当前样品位置(光片束腰处)设置为整个子阶梯的参考。此外,为了保证每次采集的图像均最优,在相机读取数据前需将样品的位置调整好,这涉及到阈值的设定,一般情况下阈值可设置为1 pixel,即CCD中反射光片的中心移动1 pixel,大概对应z轴方向光片尺度的1/30~1/10。同时还需根据实际标定情况进行一定的修正,以便达到最佳的实验效果。同时,本实验中为了保证每次成像的最优化,每次sCOMS相机数据读出过程都会进行一次样品位置的调整,这样在一定程度上会降低图像采集效率。不过这一稳定系统主要用于长时间的机械偏移校正,短时间内认为偏移可接受,因此可以设定一个时间间隔后再进行反馈。比如,当设定每间隔1 min进行一次反馈时,40~100 ms的反馈时间对于整个系统的采集速度的影响就已经小到可以忽略了。

图 4. 反馈控制下的成像流程图

Fig. 4. Flow chart for imaging under feedback control

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3 实验结果

3.1 机械漂移及其补偿

本节将从反射光片的成像质量以及实验装置的标定情况两个角度对实验原理进行验证。首先,对CCD中的反射光片进行强度分析,绘制出强度分布的半峰全宽图 ω1217。如图5所示,当N=1,5/3,5/2时,半峰全宽分别为10,17,26 pixel。这证实了调节N值,确实可以使反射光片按照特定的比例放大。不过随着N值越来越大,成像质量也随之变差。因此N值并非越大越好,而应该根据反射光片成像质量和纳米平移台的位移精度来选择。横坐标的差异是相机安装导致的,对成像质量和半峰全宽没有影响。

图 5. CCD相机中光片的半峰全宽。(a) N=1;(b) N=5/2;(c) N=5/3

Fig. 5. Full width at half maximum of light sheet in CCD camera. (a) N=1; (b) N=5/2; (c) N=5/3

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控制纳米平移台z轴以25 nm的步长进行移动,并同步对CCD中的反射光片进行强度分布分析。如图6所示,“up”表示纳米平移台向上移动,“down”表示纳米平移台向下移动,6组实验在尽量短的时间里完成,以减小无关因素的影响。由图6可知,当N=1,5/3,5/2时,CCD中反射光片的偏移总体上分别以3/5,1,3/2的斜率远离初始位置,即当N=1,5/3,5/2时,CCD中反射光片1 pixel的偏移分别对应z轴42,25,17 nm的偏移。对CCD中的反射光片进行偏移量分析时,由于偏移量只能是整数个像素,同时纳米平移台移动时也有误差,实验结果和理论值有些差异,但是这些差异不会对实验造成不可忽视的影响。综上,选择N值时,需综合考虑反射光片的成像质量、纳米平移台的精度以及光片的尺寸三个方面的因素。在本实验中,取N=5/3。

图 6. 以25 nm步长移动时CCD中反射光片的移动情况

Fig. 6. Movement of light sheet in CCD camera under step size of 25 nm

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前文中已经证实了实验原理的可靠性,这里将利用该原理对实验装置的机械偏移情况进行测试。在室温26 ℃的条件下,每间隔3 min采集一次CCD相机中反射光片图像,总共采集783 min。根据实验装置图,可知x轴和y轴方向的机械偏移原理上不会改变光片的反射表面,所以CCD相机中采集的偏移信息只是整个系统机械偏移在z轴方向上的分量,不过后续实验会证实z轴方向分量占比很大,只对其进行反馈就已经可以满足成像的质量要求。如图7所示,x轴表示时间,y轴表示偏移量。为了增强对比性,实验分无反馈下的机械偏移情况(I:0~100 min,II:220~340 min,III:460~580 min,IV:700~783 min)和有反馈下的机械漂移情况(①:100~220 min,②:340~460 min,③:580~700 min)。对于无反馈的情况,在最初的100 min出现约3.3 μm的偏移量,已经远远大于光片在z轴方向的尺度(800 nm),虽然机械偏移在III、 V和 VII三个阶段有所减小,但依然很可观;而对于有反馈的情况,z轴方向的偏移被很好地补偿。因此,实验中的反馈是一种必需且有效的补偿机械偏移的方法。

图 7. 不同情况下样品在z轴方向的机械漂移量

Fig. 7. Mechanical drifts in z axis of sample under different conditions

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3.2 荧光微球成像的补偿效果

这里将通过对1.06 μm荧光微球的长时间成像来验证实验方法在成像进程中的效果。测量时间过长时,图像会脱离视野,因此选择对微球成像2.5 h。实验在26 ℃下进行,荧光波长为595 nm,先在没有反馈情况下测量2.5 h,复原实验条件,再在有反馈的情况下测量2.5 h,通过对比成像质量来验证实验方法的可靠性。为了使实验现象便于理解,先分析机械偏移对荧光微球的影响效果。如图8所示,FM是荧光微球,x、y和z是纳米平移台坐标轴方向,假设所有的机械偏移均被投影在这三个方向上。可以发现z轴和x轴垂直于成像平面的分量z_v和x_v会迫使荧光微球沿垂直于成像平面方向移动,同时沿成像平面的分量z_p会迫使荧光微球沿成像平面的竖直方向移动,而y轴方向的偏移会使荧光微球沿着成像平面的水平方向移动。

图 8. 机械漂移对成像的影响。(a)机械漂移在垂直于成像平面方向的作用效果;(b)机械漂移在平面内的作用效果

Fig. 8. Effect of mechanical drift on imaging. (a) Effect of mechanical drift in direction perpendicular to imaging plane; (b) effect of mechanical drift in plane

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图9(a)~(d)是没有反馈下的荧光微球成像图,图9(e)~(h)是有反馈下的成像图,图中方框是边长为200 pixel的正方形区域。从成像质量上来看,在没有反馈的情况下,荧光微球图像会随着时间的推移逐渐模糊,并且背景噪声也有所增大。0 h时,在成像平面上可以清晰地观察到3个荧光微球;1 h后,最下方的荧光微球变得模糊不清;2 h后,下方的2个荧光微球均变得模糊不清;2.5 h后,3个荧光微球均变得模糊不清。在有反馈的情况下,虽然背景噪声会随着时间的推移出现一定的增加,但是在成像平面上始终能观察到3个清晰的荧光微球图像。从图像偏移上来看,当没有反馈时,随着时间的推移荧光微球在竖直方向移动了约60 pixel,由sCMOS相机的像素尺寸以及探测光路的放大率可知偏移约为3.5 μm,几乎与图7中的偏移保持一致,同时在水平方向也只有几个像素的波动,这证实了只补偿z轴方向的偏移确实可行。当有反馈时,3个微球图像始终清晰地处于视野的中心,最多也只有几个像素的漂移。因此,该实验方法是成像系统一个很好的补充,并为长时间采集下的成像质量提供可靠的保障。

图 9. 不同条件下的荧光微球成像效果图。 (a)~(d)没有反馈;(e)~(h)有反馈

Fig. 9. Imaging effects of fluorescent microspheres under different conditions. (a)-(d) Without feedback; (e)-(h) with feedback

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4 结论

由于实验中的机械偏移难以避免,长时间成像下的系统稳定性至关重要,尤其是对于超高分辨率的成像系统。如果没有反馈,成像质量会被持续恶化。本实验中,提出了一种利用4f系统和CCD相机来监测样品位置并利用纳米平移台来补偿机械偏移的方法,同时分别从原理验证和成像效果两个角度证实了所提方法的可靠性。通过一个简单的4f系统,可以对几个纳米的机械偏移进行监测并补偿,进而使成像质量始终最优。但是,由于该方法只能补偿z轴方向的机械漂移,虽然成像质量得到了很好的保证,但是成像的背景噪声会有轻微的增强。今后将同时从x、y和z三个方向来进行补偿,以消除背景噪声的影响。