1 引言

细菌是引起水体污染的重要污染物之一。掌握细菌的生长变化,估算细菌在生长过程中浓度、结构、化学组分等信息的变化,无论是对微生物学研究,还是对水体细菌微生物在线监测,都具有十分重要的意义。

目前,在细菌生长过程中进行多参数测量是识别水体细菌的重要方法之一,也是微生物学家长期以来研究的方向之一。测量水体细菌微生物浓度、大小的平板计数法、滤膜法、显微镜法等^[1-4],具有准确率较高的特点,但操作复杂,耗时长,不适合对水体细菌微生物进行实时采集和检测。细胞内大分子组分含量测量方法,如显微荧光光度法,具有检测速度快的特点,但需要荧光试剂辅助,容易污染环境^[5]。流式细胞术法具有操作简单、快速等优点,但仪器价格昂贵,不适于现场检测^[6]。

多波长透射光谱产生于光与被测样品之间的相互作用,通过光谱分析可以获得样品结构和化学组分等特征信息,多波长透射光谱技术具有测试简单、无损伤、精度高、单次确定样品多个参数等优点。一些学者已经利用该技术在生物领域开展了相关研究工作,Callahan等^[7]通过测量隐孢子虫卵囊悬浮液的透射光谱得到了隐孢子虫卵囊的大小等参数;Mattley等^[8]测量了人体血小板的透射光谱,利用光散射理论分析了细胞的数量和粒径分布;Katz等^[9]利用高斯散射理论和反常衍射理论分析了3种不同细菌的透射光谱,得到了不同细菌的平均大小。国内基于光谱学技术进行细菌微生物检测的研究较少,陶站华等^[10] 利用光镊拉曼光谱技术研究了不同环境因素对葡萄球菌黄素合成的影响;卜敏等^[11]研究了白细胞对偏振光的散射特性,结果表明散射分布规律和细胞模型的形体参量、光学参量具有相关性;王久悦等^[12]研究了细菌对可见光的散射特性,获得了细胞大小和数量参数,但未得到细菌内化学组分的信息。

本课题组以水体常见细菌——大肠杆菌为研究对象,用紫外-可见分光光度计采集其各生长阶段的多波长透射光谱,分析了不同波段的光谱特征。基于Mie散射理论和Lambert-Beer定律,对测量的透射光谱进行解析,得到了大肠杆菌生长过程中细胞浓度、大小和核酸含量的变化信息。

2 基本原理

水体细菌特征参数的反演计算主要依据Mie散射理论和Lambert-Beer定律。细菌细胞结构分为两部分:外部结构和内部结构。外部结构由细胞质和细胞壁构成;内部结构由不吸收大分子(蛋白质、多糖、脂肪等)的细胞器构成,具有特殊的折射率增量。根据Mie散射理论,在240~900 nm波段范围内,细菌悬浮液整体散射光谱的光密度表达式为^[12]

τ(λ)=Nplπ4wQscamouter(λ),D1D12+(1-w)Qscaminner(λ),D2D22,(1)

式中λ为入射光波长,N_p为单位体积的细菌数,l为光程,w为细菌外部结构对总散射光的贡献比例,D₁、D₂分别为细菌体的平均粒径和内部结构的平均粒径,Q_sca为细菌的散射系数,m_outer(λ)、m_inner(λ)分别为细菌体相对于周围介质的折射率与内部结构相对于周围介质的折射率。细菌体悬浮介质水的折射率可根据文献[ 13]的方法求得;大肠杆菌外部结构的折射率n_outer可由n_outer=1.3776+3034.9100/λ²求得^[14];内部结构的平均折射率n_inner可以由n_inner=1.5500+5900/λ²求得^[15]。

细菌中每部分的散射系数的表达式为^[16]

Qsca=2α2∑n=1∞(2n+1)(an2+bn2),(2)

式中α=πD/λ₀为无因次粒径参数,其中λ₀为入射光在细胞周围介质的波长;a_n、b_n为Mie系数,是无因次粒径参数α和折射率m_inner(λ)、m_outer(λ)的函数:

an=ψ'n(mα)ψn(α)-mψn(mα)ψ'nαψ'n(mα)ξn(α)-mψn(mα)ξ'nα,(3)bn=mψ'n(mα)ψn(α)-ψn(mα)ψ'nαmψ'n(mα)ξn(α)-ψn(mα)ξ'nα,(4)

式中ψ_n(x)= πx/2J_n+1/2(x),ξ_n(x)= πx/2· Hn+1/22(x),J_n+1/2为半整数阶Bessel函数,H_n+1/2为第二类Hankel函数。

细菌吸收部分的特征参数反演可根据Beer-Lambert 定律得到。当一束强度为I₀的入射光照射到一定浓度的样品时,由于样品的原子或分子吸收特征频率的辐射能量,使得穿过光的强度降低,吸光度与样品的浓度关系为

A=lg(I0/It)=ε(λ)cl,(5)

式中A为吸光度,I_t为透射光强度,c为光速,ε(λ)为与波长相关的吸光物质的特征常数,l为光程。通过(5)式可以在一定光程下根据物质的吸收光谱求出物质的成分和浓度。

3 实验分析

3.1 细菌培养及制备

实验使用的大肠埃希氏菌购自中国工业菌种保藏管理中心。取大肠埃希氏菌斜面菌种1支,用接种环取菌苔,接入牛肉膏蛋白胨培养液中,静止培养18 h左右,获得细菌培养液(“种子”培养液)。吸取0.2 mL细菌培养液,接种于盛有20 mL的牛肉膏蛋白胨培养基的锥形瓶内。将已接种好的锥形瓶置于摇床上振荡,温度为25 ℃,振荡频率为每分钟150次,同批培养7个样品,按标记好的培养时间取出锥形瓶,并立刻放入冰箱(4 ℃)中贮存。摇动培养瓶,分别吸取3 mL不同生长时间的细菌培养液,加入离心管中,以12000 r·min^-1的速度离心5 min。吸取其上清液,加入去离子水,以此方法清洗三遍,最后一次加入去离子水,得到细菌悬浮液。

3.2 试剂与仪器

实验所用牛肉膏、蛋白胨、氯化钠均购于国药化学试剂有限公司。实验仪器包括紫外-可见分光光度计(UV2550型)、智能培养箱(HP400G型)、无菌操作台(SW-CJ-ID型)、高速冷冻离心机(H-1650R型)、组合式光照振荡培养箱(MQP-B3G型)、石英比色皿(光程为10 mm)。

3.3 光谱测定

大肠杆菌悬浮液制备完成后,调节紫外-可见分光光度计波长为240~900 nm,采样间隔为1 nm,以去离子水作为对照,测定不同培养时间的大肠杆菌菌液的光密度,对每个悬浮液测量3次,取其平均值。在光谱采集前,需要用去离子水校正分光光度计的零点,以消除杂散光的影响。

3.4 细菌浓度的测定

将不同培养时间的大肠杆菌菌液用10倍稀释法进行一系列稀释,再用无菌吸管吸取1 mL不同稀释度的菌液(10^-5、10^-6、10^-7)于无菌平皿中,然后在平皿中分别倒入45 ℃的营养琼脂培养基。轻轻转动平皿,使菌液与培养基混合均匀,冷凝倒置,然后置于培养箱中培养(37 ℃/24 h),直至长出菌落,即可对不同平皿中的细菌进行计数。最后根据取样接种量和稀释倍数即可计算出样品中的细菌数。

3.5 细菌大小的测定

取干净的载玻片,用无菌吸管吸取少量大肠杆菌的浓菌液,制成薄涂面;涂片经酒精灯火焰固定后,依次经过如下处理:结晶紫初染1 min,水洗,碘液水洗1 min,脱色液脱色约1 min,复染液复染30 s,最后用吸水纸轻轻吸干。利用光学显微镜(CX41型)观察细菌的大小。

4 结果与讨论

4.1 细菌在培养期间透射光谱的动态变化

以细菌菌液的培养时间为横坐标,以各时间点稀释液测得的光密度(波长为600 nm)为纵坐标,得到大肠杆菌的生长动态曲线,如图1所示。由图1可见:1~3 h为延迟期,细菌主要是适应环境,生长速度较慢;3~6 h为对数期,此时细菌已适应环境,营养物质充足,处于快速生长状态;6~7 h处于对数后期,细菌繁殖速度下降,这是由于此时培养基内的营养物质减少,细菌新陈代谢产生的毒性物质开始积累。

图 1. 水体大肠杆菌在600 nm波长处随时间变化的光密度

Fig. 1. Optical density of Escherichia coli in water at 600 nm versus time

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菌液浓度在测量过程中难以控制,为了使不同培养阶段的透射光谱对应的样品浓度相等,首先对原谱线进行总和归一化处理。图2为菌液在240~900 nm波段的归一化透射光谱,纵坐标为光密度,即入射光强与透射光强之比的常用对数值,表示细菌散射和吸收的信息。由图2可知:在400~900 nm波段,随着培养时间延长,光谱的光密度逐渐增大,其原因为随着培养时间延长,细菌体内无发色团的蛋白质和脂类等物质含量的增加,使得散射能力增强。在240~300 nm波段范围内,测得的归一化光谱的光密度逐渐减小,其原因是随着细菌的平均尺寸逐渐增大,当波长比细胞尺寸小很多时,就会发生阴影效应;另一个原因是细胞器大小或数量的增加会引起光谱下降。在250~280 nm波段范围内有一个较大的吸收峰,其原因为细菌内的核酸组分在该波段范围内对光有较强的吸收作用。综上所述,在不同的生长时期,光谱有明显的变化,故而可以利用多波长透射光谱获取细菌生长过程中的特征参数变化。

图 2. 大肠杆菌菌液在不同生长时间的归一化光谱

Fig. 2. Normalized spectra of Escherichia coli suspension at different growth stages

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4.2 细菌在培养期间大小的变化

在400~900 nm波段,透射光谱主要表现为细菌微生物的整体粒径和内部所含细胞器的散射作用,反映了细菌粒径大小以及结构等相关信息^[10]。根据(1)式,利用非线性最小二乘算法对归一化透射谱进行迭代拟合,直到误差小于10^-8,即可计算出菌液的散射光谱。 根据光谱拟合结果可以得到不同培养时期细菌的宏观结构、内部结构平均大小的动

态变化,如图3所示。由图3可见:在不同的培养时间下,细菌细胞的平均大小是动态变化的;在培养前期(1~3 h),细菌的平均大小增大,这是由于细菌接种到新的培养基中时,细胞并不马上分裂,但细菌并不是完全处于静止状态,细胞的化学组分(RNA、蛋白质)的含量增加,使得细胞的体积相对增大;在细菌培养对数期(3~6 h),细菌的平均大小上下波动,这是因为在对数期一部分细胞生长,细胞体积增大,另一部分细菌开始以二分裂繁殖,单个细胞的体积变小。综上所述,细菌在培养过程中的大小是波动变化的,与文献[ 17]的结果一致。

图 3. 水体大肠杆菌不同生长时间下细胞平均大小、内部结构平均大小的变化趋势

Fig. 3. Changes of average size and the internal average size of Escherichia coli cells in water versus time

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利用显微镜观察得到了不同生长时间点具有代表性的细菌菌体大小的变化图,如图4所示。在大肠杆菌悬浮液中,细菌菌体的大小随着培养时间延长呈现先增大后波动变化的趋势,其结果与计算得到的细菌大小随时间变化的规律基本一致。

图 4. 不同生长时间下大肠杆菌显微镜图。(a) 1 h;(b) 2 h;(c) 3 h;(d) 4 h;(e) 5 h;(f) 6 h;(g) 7 h

Fig. 4. Micrographs of Escherichia coli cells at different growth stages. (a) 1 h; (b) 2 h; (c) 3 h; (d) 4 h; (e) 5 h; (f) 6 h; (g) 7 h

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4.3 细菌在培养期间的浓度变化

根据(1)式拟合得到的细菌宏观结构、内部结构平均粒径大小以及内外结构的消光比例可计算出400~900 nm波段的透射光谱,与原始测量光谱进行线性回归,可得出细菌浓度。图5为不同培养时间内细菌浓度的变化,可见:在细菌培养前期,细菌数目增长较缓慢;当进入对数期后,细菌数目快速增长;在细菌对数后期,细菌繁殖速度下降,进入大致稳定的状态。利用平板计数法对不同培养时间的大肠杆菌菌液进行检测,获得大肠杆菌菌落数。平板菌落计数法得到的水体细菌浓度变化趋势与透射光谱法的结果基本相符:在3~6 h为细菌的对数期,死亡细菌较少,两种方法计算出的细菌数目最为接近;在6~7 h为对数后期,部分细菌死亡,平板计数结果偏低。

图 5. 不同培养时间下细菌浓度的变化趋势

Fig. 5. Bacteria concentration versus time

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4.4 细菌在培养期间核酸含量的变化

大肠杆菌干物质的主要化学组分是蛋白质与核酸,几乎占整体的80%^[18]。大肠杆菌对紫外光的吸收能力主要来自于细菌内的化学组分(核酸、发色团氨基酸)。细菌微生物中核酸、发色团氨基酸和吡啶二羧酸的吸收系数与波长的关系如图6所示^[19]。

图 6. 细菌微生物中总核酸、发色团氨基酸和吡啶二羧酸的吸收系数[19]

Fig. 6. Absorption coefficients of total nucleic acid, chromophoric amino acids, and dipicolinic acid (DPA) in microorganism[19]

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在生物体中组成蛋白质的氨基酸大约有20种,这些天然氨基酸在230~310 nm波长范围内大都没有吸收,只有芳香族氨基酸——酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在250~300 nm波段均有吸收峰,其最大吸收系数对应的波长为280 nm。核酸中的核糖和磷酸在紫外区没有吸收,但嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双键系统,对250~280 nm波段的紫外光具有强烈的吸收作用。选择细菌中发色团氨基酸和核酸吸收系数最大的波段(250~300 nm)的吸光度进行分析。

已知细菌浓度、粒径大小等参数,根据(1)式可以将散射光谱扩展到240~400 nm波段范围,从而得到整个测量波段范围内的散射光谱,然后用测量所得的透射光谱减去计算所得的散射光谱,就可以得到细菌的吸收光谱。根据Lambert-Beer定律可知,某一波长处的吸光度与各组分含量呈线性关系,但在大肠杆菌细胞中,除了核酸、发色团氨基酸对光有吸收外,还有其他成分的浓度及基线等因素影响吸光度。将大肠杆菌紫外吸收光谱A(λ)分解为若干基本组分的组合,核酸、发色团氨基酸的吸光系数分别为ε₁(λ)和ε₂(λ),其他组分的吸光度用常数c₃表示(常数项),则紫外吸收光谱表达式如下:

A(λ)=c1ε1(λ)+c2ε2(λ)+c3,(6)

式中c₁、c₂分别为核酸浓度和发色团氨基酸浓度。利用多元线性回归分析可得核酸浓度。

计算得到了大肠杆菌在不同培养时间下细胞群体核酸含量的变化,如图7(a)所示,细菌群体中总核酸含量呈先增长后逐渐稳定的趋势,这是因为细菌接种到新鲜培养基后,细胞内的RNA、蛋白质物质含量增加,为细菌繁殖积累做好了准备;一段时间以后,随着营养物质的消耗,核酸增长速率降低。结果与文献[ 16]报道大肠杆菌核酸含量的变化一致。

由单位体积的核酸含量和细菌浓度的比值可以得到单个大肠杆菌细胞内的核酸含量,如图7(b)所示。在延迟期,单个细菌细胞内核酸的含量处于上升趋势,这是由于细胞内RNA、DNA含量增加,而细菌数量增加很少;进入对数期后,虽然细菌内的核酸含量有所增加,但细菌数量急剧增长,使得单个大肠杆菌细胞内的平均核酸含量处于下降的趋势。不同培养时间下单个大肠埃希氏菌细胞内的核酸含量为1.1120×10^-13~3.0920×10^-13 g/cell,这一结果在激光共聚焦显微镜方法所报道的单个大肠杆菌细胞核酸含量的合理范围内^[20]。

图 7. (a)大肠杆菌悬浮液总核酸含量随时间的变化趋势;(b)单个大肠杆菌平均核酸含量随时间的变化趋势

Fig. 7. (a) Total content of nucleotides in suspensions of Escherichia coli versus time; (b) average content of nucleotides per cell of Escherichia coli versus time

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5 结论

采用分光光度法测定大肠杆菌在生长过程中紫外-可见光波段的透射光谱。根据Mie散射理论,对水体大肠杆菌在400~900 nm波段的散射光谱进行解析,得到了细菌在生长过程中细胞结构特征、浓度信息的变化。根据Lambert-Beer定理,采用吸光系数法计算出了不同生长阶段中大肠杆菌核酸的含量变化,与文献[ 20]的数据具有较好的一致性。综上所述,基于多波长透射光谱技术可以准确获取大肠杆菌结构特征和化学组分特征参数的动态变化,为水体细菌的在线快速检测和识别提供了技术支持,也为细胞多参数测量提供了一种新方法。