本试验通过二次谐波和偏振光影像技术检测烧烫伤小鼠瘢痕胶原纤维排列和密度的变化。在小鼠背部造烧烫伤深度模型, 模仿临床烧烫伤处理方法去除结痂, 6个月时通过二次谐波和液晶偏振光影像技术从活体皮肤水平面和离体组织矢状面检测烧烫伤小鼠瘢痕和瘢痕周围乳头层以及网状层胶原纤维排列和密度的变化。二次谐波成像结果显示, 正常皮肤乳头层和网状层胶原纤维呈随机排列的网状结构, 排列一致性低, 胶原纤维排列稀疏, 面密度少, 而瘢痕和瘢痕周围乳头层以及网状层胶原纤维排列一致性和面密度均明显增加。液晶偏振光影像技术结果表明, 与正常皮肤比较, 瘢痕和瘢痕周围乳头层以及网状层胶原纤维方位角变异程度明显降低, 相位差值增加。本试验通过二次谐波和偏振光影像技术发现, 瘢痕和瘢痕周围乳头层以及网状层胶原纤维的排列和密度均发生了改变, 而且二次谐波与液晶偏振光影像技术检测的结果趋势相同, 这为将来仅通过二次谐波成像技术无创鉴别瘢痕组织奠定了基础, 同时为在人体上诊断瘢痕和评估瘢痕治疗效果提供了方法。

比较两种荧光探针异硫氰酸荧光素FITC和Cy5标记鹿茸提取物PAEs的最佳方法。用FITC和Cy5分别标记PAEs得到标记物FITC-PAEs和Cy5-PAEs; 用SDS-PAGE凝胶电泳检测并比较两种荧光染料标记蛋白分子量的差异; 用酶标仪检测在特定波长处OD值计算其标记率; 用PC12细胞验证两种荧光染料的生物安全性; 将荧光标记物分别与人工胃液和人工肠液共孵育，观察它们在其中的稳定性。结果表明，两种荧光染料标记PAEs蛋白分子量并无明显差异，但FITC-PAEs荧光强度稍强。通过计算标记率表明两种荧光染料均可充分标记PAEs，但Cy5价格昂贵。相比于FITC-PAEs，Cy5-PAEs在人工胃液和人工肠液中稳定性较差。因此，我们选择标记率高，在人工胃液和人工肠液中较为稳定且对机体无毒副作用，价格合理的FITC荧光染料标记PAEs并用于后续实验研究。这为建立蛋白类中药大分子的活性示踪方法，开发口服蛋白类药物奠定基础。

本研究旨在观察重组人源胶原蛋白(recombinant human collagen,r-hc)对小鼠皮肤激光损伤的修复作用, 初步探索其作用机制。应用458~514 nm激光照射小鼠背部皮肤制作皮肤损伤模型, 将r-hc外涂于创伤皮肤, 剂量为 8 mg/mL(生理盐水配制), 每天涂抹1次, 连续给药14 d。分别于给药后1、4、7、14 d用双光子显微镜收集二次谐波(second harmonic generation,SHG)信号检测伤口真皮中的胶原纤维, 并进行常规 HE 染色, 观察伤口局部的病理学改变。体外试验检测r-hc对人皮肤角质形成细胞和成纤维细胞增殖活力的影响, 计算细胞存活率。在小鼠模型上显示, 与对照组相比, r-hc可明显加速伤口的愈合, 缩短伤口愈合时间; SHG显示 r-hc能够促进创伤局部胶原的产生; 体外试验也显示它有促进人皮肤成纤维细胞和角质形成细胞增殖的能力。由此可见, r-hc(8 mg/mL)对小鼠激光损伤皮肤有修复作用, 可能是通过促进表皮角质细胞和真皮成纤维细胞的增殖, 促进胶原的沉积而发挥修复作用的。

目的: 用二次谐波成像结合双光子荧光成像的方法观察人源胶原蛋白透皮吸收的情况。方法: 将荧光标记的人源胶原蛋白(1 mg/mL)涂抹于小鼠表皮层经皮肤吸收1 h后用背向二次谐波观察皮肤内胶原纤维作为真皮层定位标志, 用双光子扫描共聚焦显微镜观察人源胶原蛋白透皮吸收深度, 吸收方式。结果: 二次谐波成像结合双光子荧光成像表明人源胶原蛋白透皮吸收1 h后可观察到荧光信号沿着毛囊聚集, 并有部分荧光分子由毛囊扩散至真皮层。结论: 二次谐波可以更快速, 更灵敏地检测皮肤中的胶原纤维, 以此作为检测物质透皮吸收深度的定位标志, 具有不受荧光信号干扰的优点。人源胶原蛋白可以沿着毛囊进入真皮层, 并从毛囊中扩散至胶原纤维层从而补充皮肤中的胶原纤维。