衰老是引起主动脉硬化进而引发各种心血管疾病的主要独立风险因素。对主动脉增龄性改变进行定量评估有望为心血管疾病研究提供重要线索。采用二次谐波成像技术，结合三维灰度共生矩阵纹理分析算法，对不同周龄大鼠主动脉血管壁内外表面的胶原纤维进行了定量评估；提取出多种可量化表征主动脉增龄性改变的特征参数，从胶原纤维微结构角度揭示了主动脉增龄性变化规律。上述方法及提取出的特征参数有望为评估血管老化程度提供有力工具和重要参考指标，并进一步应用于与老化相关的心血管疾病的研究。

本试验通过二次谐波和偏振光影像技术检测烧烫伤小鼠瘢痕胶原纤维排列和密度的变化。在小鼠背部造烧烫伤深度模型, 模仿临床烧烫伤处理方法去除结痂, 6个月时通过二次谐波和液晶偏振光影像技术从活体皮肤水平面和离体组织矢状面检测烧烫伤小鼠瘢痕和瘢痕周围乳头层以及网状层胶原纤维排列和密度的变化。二次谐波成像结果显示, 正常皮肤乳头层和网状层胶原纤维呈随机排列的网状结构, 排列一致性低, 胶原纤维排列稀疏, 面密度少, 而瘢痕和瘢痕周围乳头层以及网状层胶原纤维排列一致性和面密度均明显增加。液晶偏振光影像技术结果表明, 与正常皮肤比较, 瘢痕和瘢痕周围乳头层以及网状层胶原纤维方位角变异程度明显降低, 相位差值增加。本试验通过二次谐波和偏振光影像技术发现, 瘢痕和瘢痕周围乳头层以及网状层胶原纤维的排列和密度均发生了改变, 而且二次谐波与液晶偏振光影像技术检测的结果趋势相同, 这为将来仅通过二次谐波成像技术无创鉴别瘢痕组织奠定了基础, 同时为在人体上诊断瘢痕和评估瘢痕治疗效果提供了方法。

构建合适的肿瘤细胞侵袭模型、开发肿瘤细胞侵袭的定量监测方法一直是癌症研究的热点。构建了厚度超过1 mm的三维肿瘤体外侵袭模型,利用搭建的超宽带谱域光学相干层析成像系统,检测了细胞的迁移和侵袭动态,从细胞迁移距离变化和基质材料分解两方面来表征肿瘤细胞的体外侵袭过程;通过光学相干层析成像散射界面的峰值变化来定量检测肿瘤细胞的迁移距离,结合三维图像量化基质材料的表面曲度、厚度、整体体积变化来表征肿瘤细胞侵袭过程的基质材料分解与变形信息。结果表明:光学相干层析成像技术检测到的肿瘤细胞侵袭引起的细胞团簇位置变化、基质材料形态改变与苏木精-伊红染色切片、激光共聚焦结果相匹配,验证了光学相干层析成像技术检测肿瘤细胞侵袭的可行性;通过设计不同营养梯度、不同pH微环境下的三维肿瘤模型,利用搭建的光学相干层析成像系统,准确地量化了不同时间、不同体外微环境下肿瘤细胞的迁移距离、基质材料表面曲度、厚度和整体体积变化。与苏木精-伊红染色、激光共聚焦方法相比,所提方法可以连续监测肿瘤细胞的侵袭过程,更全面地反映肿瘤细胞迁移和侵袭的机理。

对胶原分子聚集行为的研究, 不仅能改善其理化特性, 同时也为其在食品、 组织工程和生物医药等领域的应用提供理论指导。 基于胶原分子中苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr)的内源荧光特性, 采用常规波长、 同步荧光和二维(2D)荧光光谱技术研究了不同浓度和温度下胶原分子的聚集行为。 研究结果表明： (1)在激发波长275 nm条件下, 胶原分子仅在发射波长303 nm处出现了归属于Tyr的特征峰; 选取波长差(Δλ)为15 nm的同步荧光扫描胶原分子, 发现其在261和282 nm处出现了分别归属于Phe和Tyr的特征峰。 (2)特征峰的荧光强度与胶原浓度呈现良好的线性关系, 表明了基于常规波长和同步荧光光谱技术对胶原定量分析的可行性。 (3)随着胶原浓度的增加, Tyr和Phe的含量逐渐增大, 且胶原分子间距逐渐降低并聚集成纤维束, 使得Tyr和Phe相互靠近并参与形成大量的氢键, 从而导致荧光强度不断增大。 然而随着温度的升高, 荧光基团与溶剂碰撞的猝灭机会增大, 且胶原分子中Tyr和Phe的荧光量子产率逐渐降低, 同时胶原分子动能增大, 其聚集体逐渐松散, 其三股螺旋结构逐渐坍塌, Tyr和Phe参与形成的氢键被破坏, 从而导致荧光强度随温度的升高不断降低。 (4)275 nm常规波长的2D荧光光谱分析表明, 胶原分子在297, 303和310 nm处出现了相关峰, 其中303 nm归属于Tyr, 297 nm归属于胶原分子聚集过程中参与氢键形成的Tyr; 310 nm可能归属于Tyr的激发态, 其不断的蓝移形成稳定的基团, 以便参与氢键的形成, 从而促进了胶原分子的聚集。 以浓度为外扰的基团响应顺序为303 nm>297 nm>310 nm; 以温度为外扰的基团响应顺序为297 nm>310 nm>303 nm。 (5)2D同步荧光光谱分析表明, 随着胶原浓度和温度的升高, Phe均比Tyr优先响应。 综上, 采用常规波长、 同步荧光光谱技术均能较好的研究胶原分子在不同浓度和温度下的聚集行为, 且为胶原的定量分析提供了一种新的方法, 但同步荧光光谱技术可将量子产率较低的Phe显现出来, 体现了其具有窄化谱带和提升分辨率的优点。 此外, 结合2D荧光分析技术, 可进一步研究胶原分子基团的响应顺序。

本研究旨在观察重组人源胶原蛋白(recombinant human collagen,r-hc)对小鼠皮肤激光损伤的修复作用, 初步探索其作用机制。应用458~514 nm激光照射小鼠背部皮肤制作皮肤损伤模型, 将r-hc外涂于创伤皮肤, 剂量为 8 mg/mL(生理盐水配制), 每天涂抹1次, 连续给药14 d。分别于给药后1、4、7、14 d用双光子显微镜收集二次谐波(second harmonic generation,SHG)信号检测伤口真皮中的胶原纤维, 并进行常规 HE 染色, 观察伤口局部的病理学改变。体外试验检测r-hc对人皮肤角质形成细胞和成纤维细胞增殖活力的影响, 计算细胞存活率。在小鼠模型上显示, 与对照组相比, r-hc可明显加速伤口的愈合, 缩短伤口愈合时间; SHG显示 r-hc能够促进创伤局部胶原的产生; 体外试验也显示它有促进人皮肤成纤维细胞和角质形成细胞增殖的能力。由此可见, r-hc(8 mg/mL)对小鼠激光损伤皮肤有修复作用, 可能是通过促进表皮角质细胞和真皮成纤维细胞的增殖, 促进胶原的沉积而发挥修复作用的。

胶原蛋白的三股螺旋结构是其不同于其他蛋白质的特殊结构， 也是其具有特殊功能的基础， 然而， 胶原的三股螺旋结构易在外界条件的影响下被破坏。 目前微波已被越来越多的应用于胶原蛋白的提取和改性过程， 但是关于微波辐照对胶原蛋白结构影响的研究还相对较少。 首先从牛跟腱中提取胶原蛋白， 然后采用05 mg·mL-1的胶原蛋白溶液在30 ℃下以微波辐照保温为实验样， 水浴加热和未经加热处理为对比样， 最后采用紫外-可见光谱、 傅里叶变换红外光谱、 圆二色谱以及荧光发射光谱等方法， 对不同加热方法中胶原蛋白的三股螺旋结构和超分子结构进行表征， 研究了微波辐照对胶原蛋白结构的影响。 实验结果表明， 在低于胶原变性温度的条件下， 无论是微波辐照还是水浴加热都不会破坏胶原蛋白的三股螺旋结构， 也不会使胶原蛋白变性。 但是， 与水浴加热相比， 微波辐照会对胶原蛋白的聚集行为产生抑制作用。 微波辐照对胶原蛋白的作用既有与常规加热相同的热效应， 又有常规加热过程中不存在的非热效应， 非热效应表现为抑制胶原蛋白的聚集行为。 研究结果可为微波场中胶原蛋白结构和性质的变化提供科学依据。

目的: 用二次谐波成像结合双光子荧光成像的方法观察人源胶原蛋白透皮吸收的情况。方法: 将荧光标记的人源胶原蛋白(1 mg/mL)涂抹于小鼠表皮层经皮肤吸收1 h后用背向二次谐波观察皮肤内胶原纤维作为真皮层定位标志, 用双光子扫描共聚焦显微镜观察人源胶原蛋白透皮吸收深度, 吸收方式。结果: 二次谐波成像结合双光子荧光成像表明人源胶原蛋白透皮吸收1 h后可观察到荧光信号沿着毛囊聚集, 并有部分荧光分子由毛囊扩散至真皮层。结论: 二次谐波可以更快速, 更灵敏地检测皮肤中的胶原纤维, 以此作为检测物质透皮吸收深度的定位标志, 具有不受荧光信号干扰的优点。人源胶原蛋白可以沿着毛囊进入真皮层, 并从毛囊中扩散至胶原纤维层从而补充皮肤中的胶原纤维。

福尔马林溶液对于固化关节软骨组织、 防止在长时间测量过程中组织的分解退化起到很好的作用, 但对福尔马林溶液浸泡后软骨组织的结构变化(固化)过程及其胶原纤维各向异性的改变却鲜有研究。 采用傅里叶变换红外光谱显微成像技术与偏振技术相结合的方法, 通过关节软骨内胶原纤维(蛋白)的红外光谱特征吸收峰(Amide Ⅰ, Amide Ⅱ带)的吸光度随福尔马林溶液浸泡时间及偏光角度的变化来研究福尔马林溶液对软骨组织结构即胶原纤维各向异性的影响, 并利用与各向异性方程拟合得到的决定系数(R2)对胶原蛋白纤维各向异性程度进行表征。 研究发现, 关节软骨Amide Ⅰ和Amide Ⅱ带的各向异性随着福尔马林浸泡时间的增长而愈加明显(Amide Ⅰ带变化尤为明显), 说明福尔马林溶液中甲醛分子诱发了胶原蛋白分子新的交联, 最终获得较好的固化效果, 有利于关节软骨的各向异性分析。 本研究将为今后关节软骨样本的制备、 储存及各向异性研究提供参考。