对胶原分子聚集行为的研究, 不仅能改善其理化特性, 同时也为其在食品、 组织工程和生物医药等领域的应用提供理论指导。 基于胶原分子中苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr)的内源荧光特性, 采用常规波长、 同步荧光和二维(2D)荧光光谱技术研究了不同浓度和温度下胶原分子的聚集行为。 研究结果表明： (1)在激发波长275 nm条件下, 胶原分子仅在发射波长303 nm处出现了归属于Tyr的特征峰; 选取波长差(Δλ)为15 nm的同步荧光扫描胶原分子, 发现其在261和282 nm处出现了分别归属于Phe和Tyr的特征峰。 (2)特征峰的荧光强度与胶原浓度呈现良好的线性关系, 表明了基于常规波长和同步荧光光谱技术对胶原定量分析的可行性。 (3)随着胶原浓度的增加, Tyr和Phe的含量逐渐增大, 且胶原分子间距逐渐降低并聚集成纤维束, 使得Tyr和Phe相互靠近并参与形成大量的氢键, 从而导致荧光强度不断增大。 然而随着温度的升高, 荧光基团与溶剂碰撞的猝灭机会增大, 且胶原分子中Tyr和Phe的荧光量子产率逐渐降低, 同时胶原分子动能增大, 其聚集体逐渐松散, 其三股螺旋结构逐渐坍塌, Tyr和Phe参与形成的氢键被破坏, 从而导致荧光强度随温度的升高不断降低。 (4)275 nm常规波长的2D荧光光谱分析表明, 胶原分子在297, 303和310 nm处出现了相关峰, 其中303 nm归属于Tyr, 297 nm归属于胶原分子聚集过程中参与氢键形成的Tyr; 310 nm可能归属于Tyr的激发态, 其不断的蓝移形成稳定的基团, 以便参与氢键的形成, 从而促进了胶原分子的聚集。 以浓度为外扰的基团响应顺序为303 nm>297 nm>310 nm; 以温度为外扰的基团响应顺序为297 nm>310 nm>303 nm。 (5)2D同步荧光光谱分析表明, 随着胶原浓度和温度的升高, Phe均比Tyr优先响应。 综上, 采用常规波长、 同步荧光光谱技术均能较好的研究胶原分子在不同浓度和温度下的聚集行为, 且为胶原的定量分析提供了一种新的方法, 但同步荧光光谱技术可将量子产率较低的Phe显现出来, 体现了其具有窄化谱带和提升分辨率的优点。 此外, 结合2D荧光分析技术, 可进一步研究胶原分子基团的响应顺序。

基于胶原基表面活性剂(collagen-based surfactant, CBS)中酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)的荧光特性, 应用恒波长差(Δλ)为15 nm的同步荧光光谱技术研究CBS浓度、 溶液pH值、 NaCl浓度和温度对其在水溶液中分子的聚集行为的影响, 并以温度为外扰, 利用二维同步荧光相关分析研究CBS分子中Tyr残基和Phe残基随温度变化的响应顺序。 结果表明, CBS分子在261和282 nm处出现了分别归属于Phe和Tyr的特征吸收峰。 随着CBS浓度的升高, CBS分子中Phe残基和Tyr残基数量逐渐增多使CBS分子聚集程度增加, 并导致荧光强度增强; CBS溶液pH值(pH 5.0)在等电点附近时, 由于CBS分子的疏水作用和氢键形成能力加强, 导致CBS分子聚集程度增强; CBS溶液中NaCl浓度的升高, 则使CBS分子间排斥力减弱, 从而导致CBS分子的聚集; 然而温度升高, CBS由聚集状态逐渐变为单分子状态, 因猝灭、 变性以及氢键形成能力降低, 荧光强度逐渐降低。 以温度为外扰的二维同步荧光相关光谱分析可知: 低温下(10～40 ℃ ), CBS聚集体随温度升高逐渐松散, 位于聚集体内部的Phe残基比Tyr残基优先响应; 而在45～70 ℃时, CBS由单分子状态逐步水解为无规卷曲构造, Tyr残基的间距变大, 氢键形成能力大大降低, Tyr残基比Phe残基优先响应。