从长枝木霉3.1029基因组中克隆了内切葡聚糖酶EGI基因, 该基因全长1 566 bp, 由3个外显子2个内含子组成, 编码461个氨基酸, 编码蛋白的N端为22aa组成的信号肽。采用重叠PCR法获得无内含子的内切葡聚糖酶基因eg1, 构建成pYE-Leg1重组质粒; 同时将其成熟肽编码序列插入酿酒酵母分泌型表达载体pYEα中, 构建成pYEα-Leg1重组质粒; 分别转化酿酒酵母。重组转化子经β-半乳糖诱导, 检测表达产物的酶活, 结果表明, pYE-Leg1转化子无明显胞外酶活; 而pYEα-Leg1转化子在刚果红平板上可产生明显的水解圈, 酶活检测显示pYEα载体可有效地将该基因在酿酒酵母中表达并分泌到胞外, 发酵液中的酶活在培养96 h达到最高1.16 U/mL, 最适酶解温度为50 ℃, 最适pH值为5.6。以上研究将为利用酿酒酵母生产胞外纤维素酶提供依据。

大肠杆菌(Escherichia coli)共表达系统常要求质粒具有不同抗生素抗性以及不同的复制子。利用粘性末端PCR技术, 以含有大肠杆菌分子伴侣基因GroEL、GroES和GrpE的pR-GESP质粒为模板, 设计两对引物, 通过两次独立的PCR反应扩增3个基因的多顺反子, 将形成粘性末端的PCR产物插入NcoI和XhoI酶切的pACYCDuet-1质粒, 构建的pA-GESP质粒具有p15A复制子及氯霉素抗性, 和具有ColE1复制子及卡那霉素抗性表达载体pET28b相容。SDS-PAGE显示含有pA-GESP质粒的大肠杆菌细胞中3个分子伴侣蛋白的表达水平和含有pR-GESP质粒的大肠杆菌细胞没有明显差异, 它们对玉米丝氨酸消旋酶的可溶性表达有部分促进作用, 但对N端含有组氨酸标签的玉米铁氧还蛋白还原酶的表达没有作用, 在三个含有不同抗生素基因的质粒中共表达分子伴侣、5-氨基乙酰丙酸合酶和尿卟啉原III甲基化酶, 两个酶连续催化的荧光产物在细胞内积累量为562.13±3.17/OD600, 而没有分子伴侣的积累量为457.66±4.98/OD600, 表明分子伴侣改善部分蛋白在大肠杆菌的可溶性表达和催化功能。

从拟康氏木霉3.3002基因组中克隆了内切葡聚糖酶EGI 基因, 该基因全长1 566 bp, 由3个外显子2个内含子组成, 编码461个氨基酸。编码蛋白EGI 的N端为22aa组成的信号肽, 其后依次为催化结构域、连接肽和结合结构域。采用重叠PCR法获得无内含子的内切葡聚糖酶基因eg1, 并将其成熟肽编码序列插入酿酒酵母分泌型表达载体pYEα中, 构建成pYEα-Peg1重组质粒, 转化酿酒酵母。重组转化子经β-半乳糖诱导, 检测表达产物的分子大小以及酶活, 结果表明, 转化子在刚果红平板上可产生明显的水解圈; 酶活检测显示该基因能在酿酒酵母中表达有生物活性的EG I并分泌到胞外; SDS-PAGE电泳显示EGI蛋白分子量比预期目的蛋白稍偏大。

根据玉米矮花叶病毒CP基因序列设计特异性引物, RT-PCR扩增玉米矮花叶病毒CP基因特异性干涉片段, 将干涉片段及pUCCRNAi 载体分别用BamH I 及Sal I 双酶切, 然后将干涉片段分别正反向插入pUCCRNAi 载体中, 构建CP基因反向重复克隆载体pUCCRNAi+2 F。再利用Pst I-Sal I 位点插入到L4440 质粒中构建原核表达载体LMCP。利用IPTG进行诱导表达并对诱导表达条件进行优化。结果表明, 经过IPTG诱导, LMCP在大肠杆菌HT115(DE3)菌株中可表达产生预期大小的核酸片段, 经DNase I 和RNase A 消化处理, 证实为dsRNA。同时IPTG浓度为0.4～0.6 mmol/L, 诱导表达4 h, dsRNA的表达量最高。另外, 溶解于ddH2O中的dsRNA 稳定性要高于溶解在NaCl 中的, 且随着放置时间的延长, dsRNA将出现明显的降解。

肉桂醇脱氢酶(cinnamoyl alcohol dehydrogenas, CAD)是木质素生物合成过程中的一类关键酶。采用RT-PCR及RACE方法从孝顺竹笋中分离出CAD基因家族的一个基因, cDNA全长是1 131 bp (GenBank注册号为GU985522), 含有一个1 107 bp的读码框, 编码一个368 aa的蛋白, 分子量约为39 kD。序列分析结果表明, 其编码的氨基酸含有CAD类基因所具有的醇脱氢酶GroES-like结构域和锌结合脱氢酶结构域, 与禾本科植物水稻、玉米等有很高的相似性, 与水稻相似性高达97.0 %。系统进化树分析同样表明, 克隆的孝顺竹CAD基因与水稻的CAD基因的亲缘关系最为接近。组织特异性表达分析显示, CAD基因在孝顺竹笋中表达量最高, 在茎、叶和杆箨中亦有低水平表达。本研究将为更深入的研究孝顺竹CAD基因的分子调控研究奠定基础。

以发根农杆菌A4、LBA9402、R1000为实验菌株, 从胡萝卜中成功诱导出可在无激素条件下快速生长的毛状根, 通过PCR方法对其进行了初步鉴定。该毛状根在MSR培养基上生长迅速, 1个月左右即可长满整个平板, 并经多次继代后仍保持其特性。研究了菌株类型、培养基、菌液量、菌液浓度和共培养天数对胡萝卜毛状根转化频率的影响, 筛选出的较优胡萝卜发根条件为: 使用A4发根农杆菌菌株, 共培养培养基为添加50 mg/L Vitamin C(Vc)的水琼脂, 加菌量20 μL, 侵染液OD600值0.6, 共培养天数2 d。胡萝卜毛状根诱导体系的建立和条件优化为其他植物毛状根的诱导提供了技术参考, 同时为进一步研究胡萝卜的次生代谢及建立菌根共生体系等奠定了基础。

5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinate acid, ALA）在农业, 工业, 医药业具有广泛的应用。ALA由5-氨基乙酰丙酸合酶（5-aminolevulinate acid synthase, ALAS）催化产生, 其生物合成受终产物血红素的反馈抑制。本研究克隆一种浑球红细菌的hemA基因, 序列分析其与已报道的基因具有96 %的同源性, 蛋白质编码区域也发生改变, 并利用生物信息学软件进行同源关系的分析。采用大肠杆菌重组技术, 构建表达载体pET28a-hemA, 表达了有活性的浑球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）的ALAS, 研究了IPTG诱导和PH对研究ALAS的影响, 同时分析了重组菌株合成ALA的能力, 测定胞外产量。结果表明, 在PH 6.5, 30 mmol/L琥珀酸和60 mmol/L甘氨酸培养条件下, 胞外ALA的最大合成量达到669 mg/L。

选取我国7个栽培玉米亚种材料, 进行5 S rDNA的非转录间隔区(nontranscribed intergenic spacer, NTS) 的序列分析, 比较7个亚种材料NTS序列差异并进行聚类分析, 探讨其亲缘关系。研究结果表明: 7个材料的NTS区GC平均含量为45.67 %, 核苷酸位点变异位点个数1~15, 转换/颠换率为0.83~2.0, 特用玉米材料均存在不同程度的缺失; 7个材料主要聚为两大类, 第一类群中包括甜质、马齿、硬粒、爆裂和蜡质5个亚种材料, 第二类群中包括粉质和甜粉2个亚种材料。同时利用荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH) 对5 S rDNA进行定位, 探针标记分别采用荧光素标记和生物素标记。结果表明: 生物素标记检测系统灵敏度高、杂交信号强, 更适合于5 S rDNA重复序列的定位检测。

从玉米幼嫩叶片中提取玉米叶绿体基因DNA, 通过PCR克隆出叶绿体同源重组片段trnA和trnI、叶绿体特异性启动子Prrn以及终止子psbA。构建玉米叶绿体表达载体pBAIRTARED, 含有一个人工操纵子, 其中, 筛选标记基因aadA和红色荧光蛋白报告基因AsRED处于Prrn启动子和psbA终止子控制。将构建的载体转化大肠杆菌BL21(DE3), 观测到重组细胞呈现红色, 表明构建的载体可以用于玉米叶绿体转化以及表达报告基因。

在植物的生长发育过程中, 细胞分裂素在调节细胞分裂和组织发育中起着非常重要的作用。研究表明细胞分裂素的信号转导是一种双组分信号转导途径, 在这个系统中, 由3种蛋白组成, 分别是组氨酸激酶、磷酸转移蛋白和反应调控因子。利用已经克隆的玉米和水稻细胞分裂素反应调节因子基因, 进行BLAST分析从玉米全基因组中获得候选ZmRR类型基因。然后设计全长基因引物, 通过Trizol法提取玉米叶片总RNA, 利用RT-PCR技术克隆出全长候选基因。序列分析表明所扩增序列含有完整的编码框, 共编码156个氨基酸残基。序列比对分析其与ZmRR1-10基因具有较高的同源性, 并命名为ZmRR11, 系统进化树分析证实其属于A类细胞分裂素调控因子, 并对所有ZmRR类型基因进行motif分析, 共发现37个保守的motif。该基因的克隆和进化分析对阐明玉米双元信号传导体系具有重要的意义。