短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)X23可产生非核糖体肽类抗生素伊短菌素, 已被广泛用于植物病害的生物防治。伊短菌素合成基因簇中, edeB基因参与调控伊短菌素的合成积累。本研究利用基因同源重组技术, 以edeB基因作为外源基因的重组片段, 构建了原核表达载体pET28a-edeB, 转化至大肠杆菌BL21(DE)中进行诱导表达; 通过转录组测序检测edeB基因在短短芽孢杆菌不同培养时间(12、18、24、30和36 h)的转录时相。结果表明: edeB基因全长为771 bp, 编码256个氨基酸。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示, 在分子质量为30 kD处有一条特异条带, 与生物信息学预测的EdeB蛋白的大小一致, 且EdeB蛋白主要以包涵体的形式存在。转录时相分析结果表明, edeB基因在各个培养时间点均有表达, 表达模式为先升高后降低, 且在30 h时表达水平最高。这些结果为进一步研究edeB基因调控伊短菌素合成积累的分子机制奠定了基础, 为短短芽孢杆菌高产伊短菌素菌株的构建提供了理论依据。

本研究利用生物信息学结合RT-PCR技术从二穗短柄草(Brachypodium distachyon)中克隆出BdAD1的cDNA基因, 该基因编码一个包含500个氨基酸残基的乙醛脱氢酶家族蛋白。系统进化关系分析表明, 该BdAD1蛋白序列与小麦(Triticum aestivum)、羊草(Leymus chinensis)和大麦(Hordeum vulgare)的同源蛋白具有较近的亲缘关系。BdAD1基因在植物细胞的细胞核和细胞质中均有表达, 而且BdAD1蛋白兼具松柏醛脱氢酶和芥子醛脱氢酶的活性(CALDH/SALDH), 可将松柏醛与芥子醛分别酶解生成阿魏酸和芥子酸, 但它对松柏醛的催化效率显著高于芥子醛, 因此推测BdAD1可能在苯丙烷代谢途径中对阿魏酸的合成具有重要的调控作用。

目的: 高效表达与纯化可溶性重组人PCT蛋白, 制备高灵敏度和高特异性的抗人PCT医用诊断单克隆抗体。 方法: 大肠杆菌表达重组人PCT蛋白后, 利用饱和硫酸铵沉淀和亲和层析方法纯化PCT蛋白后, 经质谱、Western blot和间接 ELISA法进行性质鉴定和分析重组蛋白的表达与免疫反应性; 重组蛋白免疫小鼠, 经细胞融合及筛选制备抗PCT单克隆抗体(mAb)。 结果:在大肠杆菌中高效表达了人PCT蛋白; 重组人PCT蛋白具有良好的免疫反应性与免疫原性; 经筛选获得7株抗PCT单克隆抗体细胞株, 经ELISA鉴定, 筛选抗体可与PCT抗原有良好的特异性反应。 结论: 利用重组人PCT蛋白免疫制备了抗人PCT单克隆抗体, 为进一步研发PCT快速诊断试剂提供了原料。

家蚕(Bombyx mori)黄体色突变体 (lem)的幼虫体壁富含墨蝶呤 (SP), SP经墨蝶呤还原酶 (SPR)的催化作用合成四氢生物蝶呤(BH4)。作为芳香族氨基酸羟化酶的重要辅酶, BH4的缺乏会导致多种神经性代谢综合症。前期研究已克隆获得家蚕SPR基因(BmSpr), 确定了BmSpr为lem突变体的遗传本质。本实验将重组质粒 pET-24b-BmSpr转化至E. coli不同菌株的感受态细胞, 对BmSpr的体外表达条件进行了优化。SDS-PAGE和Western Blot的检测结果表明BmSPR融合蛋白能够在原核表达系统中得到稳定表达, 酶活性分析结果显示体外表达的重组BmSPR对其底物SP有较好的催化活性。本研究为进一步以从家蚕lem突变体资源大量提纯的SP为底物, 利用原核表达BmSPR, 开展体外合成 BH4的应用基础研究奠定了实验基础。

为构建东方马脑炎病毒E2基因原核表达载体, 完成E2蛋白表达及其免疫活性研究。利用PCR方法扩增E2编码全基因, 大小为1 260 bp, 将酶切后目的片段连接到原核表达载体pET-30a(+)上, 构建成重组质粒pET30a(+)-EEEV-E2, 采用酶切和测序分析方法鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21中, 诱导E2蛋白表达, 并用SDS-PAGE电泳和Western-blotting分析和鉴定目的蛋白; 最后, 用纯化的E2蛋白免疫BALB/c小鼠, 小鼠随机分成4组: PBS对照组、弗氏佐剂对照组、E2蛋白免疫组和E2蛋白+弗氏佐剂免疫组, 每组小鼠免疫2次, 两次免疫间隔时间为14天, 免疫剂量均为100 μL/只; 小鼠初次免疫后第10天, 用细胞因子ELISA试剂盒检测血清中IL-6、IL-12与TNF-α的浓度, 加强免疫后第14天, 用EEEV的假病毒检测血清中E2蛋白抗体的中和作用。结果表明完成了E2基因的原核表达载体pET30a(+)-E2构建和成功表达了带有His标签的E2融合蛋白, 蛋白以包涵体形式存在, 大小为53.0 kDa; 免疫小鼠血清中产生了高水平的IL-6、IL-12与TNF-α和具有较强中和作用的E2蛋白抗体。研究结果为今后E2蛋白作为基因工程亚单位疫苗的研究提供了重要参考。

为获得分泌抗人β-actin蛋白单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞, 通过在大肠杆菌中原核表达人β-actin蛋白, 以纯化的人β-actin蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠。经过细胞的融合及筛选获得1株能稳定分泌抗人β-actin蛋白McAb的杂交瘤细胞, 命名为2B4。采用间接ELISA和Western blot方法对McAb的特异性、稳定性和适用范围进行鉴定。结果显示: 蛋白的相对分子质量为43 kDa, 可溶于8 mol/L尿素; 杂交瘤细胞上清的抗体效价为1×105, 腹水的抗体效价为1×107; 间接ELISA结果表明, 杂交瘤细胞在体外传20代或液氮冻存3个月后, 分泌的抗体效价不变; 37 ℃保存24 h后, 抗体的效价开始下降。Western blot结果显示, 单克隆抗体识别人、鼠、兔和鱼的β-actin蛋白, 与其发生特异性反应。2B4分泌的单克隆抗体可以广泛的应用于细胞生物学和免疫学试验, 具有良好的应用价值。

构建钙激活酶激活蛋白基因(UK114)的原核表达载体并优化其表达条件,为其高效表达提供试验依据。以UK114 cDNA为模板,通过PCR方法扩增钙激活酶激活蛋白基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-3中, 酶切及测序鉴定重组体。将构建好的重组质粒转化大肠埃希菌BL21 (DE3) , 用IPTG进行诱导表达, 在保持菌种不改变的前提下,分别改变IPTG的浓度、培养时间、菌体浓度、培养温度等来优化表达条件。结果显示,原核表达载体pGEX-4T-3-UK114成功构建,可在大肠埃希菌BL21 (DE3)中诱导表达,得到相对分子质量约40 kD的GST-UK114融合蛋白。在IPTG浓度为0.3 mmol/L, 诱导温度为32 ℃, 诱导时间为4 h, 菌体密度OD600为0.6的条件下,目的蛋白表达量最高。试验成功构建原核表达载体pGEX-4T-3-UK114且获高效表达,为研究UK114生物学活性及产品开发提供了试验基础。

制备果蝇心脏标记基因Hand抗体对研究果蝇心脏发育具有重要意义。从果蝇体内提取出总RNA, 反转录得到果蝇的cDNA, 将其作为模板PCR得到Hand基因部分片段, 将片段连接到pET-28a上, 构建重组质粒pET-28a-Hand, 将重组质粒转化rosetta受体菌, IPTG诱导表达, 表达产物经镍柱纯化, SDS-PAGE 电泳分析, 结果表明Hand基因在大肠杆菌中成功表达, 表达的Hand融合蛋白分子量大约为24 kD, 经镍柱纯化后获得了高纯度可溶性的Hand蛋白。

Bzw2(basic leucine zipper and W2 domains 2)基因是人类心脏发育候选基因, 它由bzip结构域和W2结构域构成。为了研究该基因在心脏发育过程中的作用, 利用生物信息学信息克隆了人类Bzw2基因全长, 将所得的片段插入到原核表达载体pGEXT-4T-1 载体中, 利用BL21菌株表达该重组质粒, 经过IPTG诱导, 得到GST-Bzw2融合蛋白, 蛋白经纯化分离后免疫新西兰大白兔, 并用Western blotting 检测抗体效价。利用抗体进行了心脏, 肌肉, 脑组织表达检测, 结果显示, Bzw2在心脏, 肌肉, 脑组织中高表达。

odd是一个新发现的心脏特异表达基因。为了进一步研究odd在心脏发育中的功能, 根据已报道的odd基因序列, 以果蝇cDNA文库为模板进行PCR扩增, 将所得的odd部分编码区序列连接到pET-28a载体上构建原核表达载体; 重组子经酶切测序鉴定后, 转化到大肠杆菌BL21菌株, IPTG诱导融合蛋白表达, Ni-IDA凝胶柱亲和纯化, 纯化后的His-odd融合蛋白免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体, Western Blot检测抗体活性。结果表明, 获得了odd原核表达重组融合蛋白以及高效价的、特异性兔抗Odd多克隆抗体, 为后续的odd功能研究奠定了基础。