Fbxl5为F-box基因家族的一员, 目前研究发现其与心脏的发育有关。为了在斑马鱼模型中进一步研究该基因的功能, 有必要制备其多克隆抗体。通过桥式PCR扩增出亲水性和特异性均好的斑马鱼Fbxl5基因片段, 将其克隆入表达载体pET-28a, 转化至大肠杆菌Rosseta中。用IPTG诱导Fbxl5重组质粒得到His-Fbxl5的融合蛋白。这个融合蛋白用Ni-IDA凝胶柱亲和纯化, 将纯化的His-Fbxl5融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。使用Western Blot检测, 获得了Fbxl5原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Fbxl5多克隆抗体。随后检测了Fbxl5在斑马鱼胚胎和成体组织中蛋白的表达, 通过基因芯片分析在Fbxl5-MO和Std胚胎样品的mRNA含量差异.所得结果显示获得了较高效价和特异性好的斑马鱼Fbxl5多克隆抗体, 为Fbxl5功能的进一步研究奠定了基础。

Kruppel在果蝇发育过程中起着重要的调控作用。为了进一步研究Kruppel的功能, 需要制备Kruppel蛋白及其抗体.对已有的Kruppel序列进行分析, 选取适当区域进行引物设计, 从果蝇心脏cDNA文库中PCR扩增得到Kruppel部分编码区序列, 并其连接到pET-28a载体上。将重组质粒(pET-28a-Kruppel)转化rosetta受体菌, 通过IPTG(Isopropyl β-D-thiogalactoside)诱导表达融合蛋白, 用镍柱进行亲和纯化。将纯化得到的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体, 并用Western blot检测抗体的效价。

lbe是已经证明的心脏标记基因。为了深入研究lbe在心脏发育中的功能, 需要获得lbe蛋白并制备其抗体。首先提取野生型成体果蝇的总RNA, 反转录获得其cDNA文库, 通过PCR克隆出lbe编码区序列, 将其连接到pET-28a原核表达载体上。经酶切及测序鉴定后, 质粒构建成功。将重组质粒(pET-28a-lbe)转化大肠杆菌菌株Rosseta,用IPTG诱导表达出融合蛋白, 经Ni-IDA凝胶柱纯化后, 最后将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备lbe多克隆抗体,并用Western blotting检测抗体的效价和特异性。结果显示获得了lbe原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗lbe多克隆抗体, 为lbe功能的进一步研究奠定了基础。

本研究以随机GFP::cDNA融合基因转基因拟南芥为材料, 筛选到在细胞核或在细胞核和细胞质中均表达GFP信号的转基因株系58个。对这些转基因株系中的cDNA插入片段进行克隆, 获得4株插入片段能按原初编码框进行编码的转基因株系。对插入片段为编码富含甘氨酸蛋白AtGRP8 C-末端(富含甘氨酸的结构域)的转基因株系R2的表型分析发现, 连续白光、红光或蓝光下其幼苗的下胚轴比野生型的要短, 且较低光照强度白光(低于100 μmol m-2 s-1)、蓝光(低于75 μmol m-2 s-1)下的差异更加明显, 但是黑暗中其幼苗的下胚轴与野生型相比无明显差异, 表明AtGRP8蛋白可能通过其C-末端功能域参与调控拟南芥的光形态建成反应。

ATF4是含有bZIP结构域的ATF/CREB转录因子家族成员, 对胚胎的发育以及细胞的增殖、分化有重要的调节作用。制备ATF4的多克隆抗体对于研究其在斑马鱼心脏发育过程中的作用有重要的意义。研究首先通过生物信息学方法, 选择ATF4基因中特异性强、具亲水性的一段核苷酸序列(1 017 bp), 通过PCR扩增, 将片段重组到原核表达载体pET-28a, 然后转化入Rosetta菌株中。经测序鉴定正确后, 用IPTG诱导表达融合蛋白, 以该融合蛋白免疫小鼠,获得ATF4多克隆抗鼠血清。对该多抗血清抗体进行验证, 具有很好特异性和较高效价, 可以用作Western-blotting、免疫印迹等试验分析。

6-磷酸己酮糖合成酶(HPS)和6-磷酸果糖异构酶(PHI)是细菌同化甲醛的关键酶。 13C-NMR分析结果说明在天竺葵叶绿体中过量表达HPS/PHI融合蛋白可把RuMP途径整合成卡尔文循环的一个支路, 在转基因天竺葵叶绿体中创造一个甲醛光合同化途径。 运用FTIR技术分析过量表达HPS/PHI转基因与野生型天竺葵在甲醛胁迫下体内各物质含量的变化规律及光谱表征, 考察FTIR能否成为一种鉴定有甲醛光合同化途径的转基因植物与野生型植物表型差异的新方法。 分别用4 mmol·L-1甲醛处理野生型和转基因植物0,　1,　2,　3,　4　d,通过对两种植物经甲醛处理不同时间后各光谱特征的比较分析发现,　用4　mmol·L-1甲醛处理4　d后转基因植物中的碳水化合物、 蛋白质、 脂肪族化合物等的含量明显高于野生型植物。 这可能是由于安装HPS/PHI甲醛光合同化途径后使转基因植物同化代谢甲醛的能力更强,能将更多的甲醛固定为6-磷酸果糖, 然后进入各种同化途径用于合成细胞内的各种组份所致, 说明FTIR可作为一种鉴定有甲醛光合同化途径的转基因天竺葵与野生型天竺葵表型差异的新方法。

odd是一个新发现的心脏特异表达基因。为了进一步研究odd在心脏发育中的功能, 根据已报道的odd基因序列, 以果蝇cDNA文库为模板进行PCR扩增, 将所得的odd部分编码区序列连接到pET-28a载体上构建原核表达载体; 重组子经酶切测序鉴定后, 转化到大肠杆菌BL21菌株, IPTG诱导融合蛋白表达, Ni-IDA凝胶柱亲和纯化, 纯化后的His-odd融合蛋白免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体, Western Blot检测抗体活性。结果表明, 获得了odd原核表达重组融合蛋白以及高效价的、特异性兔抗Odd多克隆抗体, 为后续的odd功能研究奠定了基础。

心房钠尿肽ANF是钠尿肽家族中的一员, 是心肌细胞分泌的一种循环激素, 主要在心房组织分泌。生物信息学分析表明, 斑马鱼ANF基因开放阅读框全长321 bp, 编码106个氨基酸, PCR扩增获得斑马鱼ANF基因全长。将所得的PCR片段插入原核表达载体pGEX-4T-1中, 并将重组质粒(pGEX-4T-1-ANF)转化大肠杆菌BL21。通过IPTG诱导表达GST-ANF融合蛋白, 经GST亲和层析法纯化后, 免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体, Western blotting分析表明, 制备的抗体具有良好的高效价性和特异性。

斑马鱼charon基因位于1号染色体上, 其成熟肽编码区含有731 bp, 编码243个氨基酸。charon基因编码Cerberus/Dan家族的一种分泌因子, 它与心脏的左右不对称发育有关。为进一步研究charon在心脏左右不对称发育中的功能, 以斑马鱼为动物模型, 利用RT-PCR的方法成功克隆了斑马鱼charon基因片段, 并将其进行原核表达, 制备了charon多克隆抗体。通过western blotting对抗体进行分析,结果表明: 实验获得了效价较高、特异性较好的charon多克隆抗体,而且charon在斑马鱼中表达较为广泛, 在心脏、肌肉、眼睛等组织表达尤其明显。

CXXC5基因是从人类胚胎心脏的cDNA文库中克隆出来的一个人类锌指基因, 包含zf-CXXC5结构域, 该基因编码322个氨基酸, 在物种进化上高度保守。为了进一步研究该基因的功能, 需要获得CXXC5蛋白并制备其抗体.通过PCR扩增方法扩增得到了CXXC5部分编码区序列, 然后将其连接到PGEX-4T-1 上, 转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中, 再通过自身诱导法诱导表达重组质粒的融合蛋白. 通过割胶回收纯化融合蛋白。免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体, Western blot 检测抗体活性。结果表明, 实验获得了高质量的多克隆抗体。