为了在动物体内研究Fbxl5基因是通过什么机制导致斑马鱼心脏出现突变表型, 本文利用近几年兴起的CRISPR/Cas9打靶技术建立斑马鱼Fbxl5基因敲除品系。本文将打靶位点定位于Fbxl5的F-box结构域, 也就是Fbxl5的第五号外显子上。首先经过基因打靶网站分析筛选出针对Fbxl5基因F-box结构域最适合的打靶位点, 扩增出Fbxl5基因CRISPR/Cas9打靶双链DNA, 并转录为RNA, 与Hcas9共注射至斑马鱼胚胎。最后, 在注射48 h后对Fbxl5基因CRISPR/Cas9打靶的有效性进行检测。首先在注射48 h之后收集胚胎提取基因组DNA, 用特异性引物进行PCR扩增; 将纯化后的Fbxl5基因PCR产物连接到pMD18-T载体, 再经质粒提取, 测序分析, 通过与WT斑马鱼基因组序列进行比对发现Fbxl5-9号在PAM序列AGG下游缺失了4个碱基。证明该CRISPR/Cas9 系统在敲除心脏发育候选基因Fbxl5是有效的, 该研究为最终获得Fbxl5基因敲除斑马鱼奠定了良好的基础。

Fbxl5为F-box基因家族的一员, 目前研究发现其与心脏的发育有关。为了在斑马鱼模型中进一步研究该基因的功能, 有必要制备其多克隆抗体。通过桥式PCR扩增出亲水性和特异性均好的斑马鱼Fbxl5基因片段, 将其克隆入表达载体pET-28a, 转化至大肠杆菌Rosseta中。用IPTG诱导Fbxl5重组质粒得到His-Fbxl5的融合蛋白。这个融合蛋白用Ni-IDA凝胶柱亲和纯化, 将纯化的His-Fbxl5融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。使用Western Blot检测, 获得了Fbxl5原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Fbxl5多克隆抗体。随后检测了Fbxl5在斑马鱼胚胎和成体组织中蛋白的表达, 通过基因芯片分析在Fbxl5-MO和Std胚胎样品的mRNA含量差异.所得结果显示获得了较高效价和特异性好的斑马鱼Fbxl5多克隆抗体, 为Fbxl5功能的进一步研究奠定了基础。