WBP11是 WW结构域结合蛋白家族的一员, 参与前体 mRNA剪接过程, 是重要的剪接因子。斑马鱼作为重要的模式生物之一, 其基因组中含有人类 WBP11的同源基因 wbp11。为了研究 WBP11在脊椎动物早期发育过程中的作用机制, 利用 CRISPR/Cas9技术构建了斑马鱼 wbp11基因敲除品系。首先, 在 wbp11基因的第二个外显子上设计基因敲除靶位点, 体外转录合成 sgRNA, 通过显微注射技术对斑马鱼进行基因敲除, 得到 F0代嵌合体斑马鱼。随后, 将嵌合体斑马鱼与野生型斑马鱼杂交, 所得到的 F1代斑马鱼进行基因型鉴定, 筛选出其中的杂合子斑马鱼, 并对杂合子斑马鱼的缺失条带进行测序, 结果显示其为 wbp11基因的 2种缺失突变。让同种突变的 F1代杂合子斑马鱼自交, 对得到的后代 F2进行基因型鉴定, 筛选获得了纯合子斑马鱼, 表明 wbp11基因敲除品系构建成功。经显微镜白光成像观察发现, 受精后 48 h的斑马鱼出现心包水肿、心脏线性化、骨骼弯曲畸形, 这可能是由于 wbp11基因突变引起剪接机制异常所导致的。此研究为探究 WBP11基因在脊椎动物的早期发育中的作用机制开辟了道路

甲醛溶液浸泡的人类组织样本很多情况下是可遇不可求的珍贵资源, 而其 DNA 的提取是一大难题。本文分别使用改进的甲醛溶液浸泡样本基因组DNA提取方法以及通用型基因组DNA提取试剂盒, 对四份不同时间固定的福尔马林浸泡的人类胚胎皮肤和肌肉的样本进行基因组DNA提取。使用紫外分光光度计鉴定所提取DNA的纯度和质量浓度, DNA溶液点样进行琼脂糖凝胶电泳及成像, 结果显示, 改进的提取方法所得基因组DNA的质量浓度和纯度均优于通用型基因组DNA提取方法。以提取所得的基因组DNA模板进行PCR扩增, 电泳结果显示, 改进的提取方法所提取的基因组DNA有更好的PCR扩增效果。本研究为甲醛溶液浸泡的珍贵样本的基因组DNA的提取提供了方法指导和改进方向的参考。

心脏神经脊衍生物表达转录因子2(Hand2)是bHLH家族的成员, 也称为dHand、Hed和Thing2, 可在人以及鼠、鸡、斑马鱼、果蝇等模式动物中表达。国内外的研究显示, Hand2主要影响右心室的发育, 在维持右心室祖细胞和右心室形态发生中起关键作用。为了进一步研究Hand2基因参与心脏发育的作用机制, 拟通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建斑马鱼Hand2基因敲除品系。根据生物信息学网站的分析筛选出最优的两个靶位点, 设计并合成引物, 利用PCR扩增得到Hand2基因sgRNA的cDNA, 再转录为mRNA, 将两个靶位点sgRNA的mRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼胚胎的Ⅰ-细胞期。在斑马鱼的胚胎和成鱼时期进行基因敲除的有效性检测, 发现在靶位点附近有碱基的缺失和插入, 表明CRISPR/Cas9对斑马鱼Hand2基因敲除是有效的。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了斑马鱼的Hand2基因敲除模型, 为后期研究Hand2基因在人类疾病中的作用机制和新型治疗靶点的临床开发等奠定了基础。

黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的心脏发育调控基因与人类的相关基因具有高度同源性。Lbe基因是果蝇心脏发育的重要调控基因。为了深入研究Lbe基因在心脏发育中的调控功能, 采用DNA免疫技术制备了抗果蝇Lbe蛋白的多克隆抗体。通过PCR扩增Lbe基因序列, 将该序列与真核表达载体pCAGGS-P7同源重组, 以该同源重组载体免疫4周龄小鼠, 获得含有抗Lbe多克隆抗体的血清。蛋白质印迹(Western blot)和胚胎抗体染色结果表明, 该抗体的特异性较好。该抗体为随后的Lbe功能的研究奠定了基础。

研究果蝇的心脏发育基因表达调控机制, 其相应靶点的抗体必不可少。但目前市场上缺乏此类商用抗体, 因此本研究选择果蝇心脏发育中的标记基因Svp(Seven-up), 并采用DNA免疫技术来快速制备其抗体。首先通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出Svp基因编码区部分序列, 然后将其连接到真核表达载体pCAGGS-P7上, 再将重组质粒pCAGGS-P7-Svp直接注射进小鼠体内, 使外源基因在活体内表达, 产生的抗原激活了小鼠的特异性细胞免疫和体液免疫, 从而分泌相应的抗体, 取小鼠的血清收集获得抗体。最后用蛋白质印迹(Western blot)和胚胎免疫荧光技术检测Svp抗体的效价和特异性。结果表明, 制备的Svp多克隆抗体具有高效价和特异性, 为后续的果蝇心脏发育研究奠定了基础。

H1N1流感病毒属于常见的致病性病毒。流行病学调查研究表明, 新生儿表型缺陷与流感病毒感染有关, 但是具体机制还不明确。为了探讨H1N1流感病毒对胚胎发育的影响, 本文通过流感病毒感染孕母鼠来构建流感病毒宫内感染的动物模型, 分别在胚胎发育至E14.5、E15.5、E16.5、E17.5、E18.5 d以及出生1 d后测量各胚胎的体长, 并在体视镜下观察胚胎体表各血管和器官来分析胚胎外表发育的情况, 然后采用阿尔新蓝-茜素红染色法观察各发育时期胚胎骨骼发育的情况。结果表明, 流感病毒感染的小鼠胚胎的体长明显降低。外部器官发育的差异性可体现在眼、耳等器官, 攻毒组成型稍晚, 尾部异常卷曲更为严重。各骨骼发育攻毒组较对照组更迟缓, 但没有出现长短肢或骨骼缺失等严重异常表型。本研究首次构建了流感病毒宫内感染的动物模型, 探究了H1N1流感病毒对小鼠胚胎表型发育的影响。

ASB11参与胚胎神经祖细胞的发育、再生性肌发生以及泛素化等过程,但其机制仍不清楚。为了进一步研究斑马鱼Asb11基因的作用机制,本研究采用DNA免疫技术制备了ASB11多克隆抗体；利用斑马鱼Asb11的cDNA构建pCAGGS-P7/ASB11重组表达质粒,肌肉注射入6-8周龄的BALB/c小鼠体内,诱导抗原蛋白的表达和免疫应答的发生。结果显示,制备的pCAGGS-P7/ASB11重组质粒具有较好的免疫原性；将提取的抗血清进行Western-blot和免疫荧光检测,显示所制备的多克隆抗体抗体效价为1∶400,抗血清抗体能特异的结合ASB11蛋白。本研究为后续的功能研究奠定了基础。

Asb11基因被报道与斑马鱼Notch信号的激活有关,本研究室过去的研究显示该基因在心肌和骨骼肌中特异性表达。因此推测Asb11基因可能是心脏发育相关候选基因。为了阐明Asb11基因在斑马鱼心脏发育过程中的作用,本文利用CRISPR/Cas9打靶技术构建敲除Asb11基因的斑马鱼品系。首先在线分析筛选出Asb11基因最适合的打靶位点,然后PCR扩增出Asb11基因gRNA的双链cDNA,再将Asb11基因的gRNA和Hcas9的mRNA共同注射到斑马鱼胚胎Ⅰ细胞期胚胎中。进行打靶的有效性检测,发现Asb11基因的一号外显子出现了碱基的缺失,表明CRISPR/Cas9 系统对Asb11基因的敲除是有效的。对其F0代、F1代、F2代进行筛选,成功获得了Asb11基因敲除的斑马鱼品系,为探究Asb11在心脏发育中的作用奠定了基础。

转录因子GATA1对正常红系细胞的分化起着关键作用, 其缺失导致原成红细胞的凋亡, 其过表达则能抑制红系细胞晚期的分化。本研究为了进一步利用斑马鱼研究gata1基因在血液血管发育过程中的功能, 通过反转录PCR(RT-PCR)扩增了斑马鱼gata1基因编码区序列, 构建了真核表达质粒pCAGGS-P7/gata1, 采用质粒DNA免疫技术的方法免疫了BALB/c小鼠, 制备了斑马鱼GATA1蛋白多克隆抗体。实验结果表明: 构建的真核表达重组质粒pCAGGS-P7/gata1 DNA具有良好的免疫原性, 在免疫小鼠后所获得的抗血清抗体效价达1∶500。Western blot和免疫荧光检测表明, 抗血清能特异型地识别GATA1蛋白。斑马鱼GATA1抗体成功制备为进一步的功能研究奠定了重要基础。

CRISPR/Cas9基因打靶技术是近几年发展起来的一种高效率的定向打靶技术, 被认为是遗传领域的革命性技术。Titin-Cap基因是本实验室已初步鉴定的斑马鱼心脏发育候选基因, 且国内外目前尚无斑马鱼Titin-Cap基因的敲除品系。为了研究Titin-Cap基因在心脏发育过程中的作用机制, 我们利用CRISPR/Cas9基因打靶技术建立斑马鱼Titin-Cap基因的敲除品系。测序结果显示, 注射了CRISPR/Cas9 gRNA的胚胎出现双峰, 说明在打靶位点附近出现了碱基缺失或插入, 证明我们设计的gRNA是有效的。对F0代突变体成鱼的筛选中, 测序结果同样显示有阳性结果。这些结果说明用CRISPR/Cas9基因打靶技术成功敲除了斑马鱼Titin-Cap基因, 获得了Titin-Cap基因敲除的嵌合体斑马鱼。