WBP11是 WW结构域结合蛋白家族的一员, 参与前体 mRNA剪接过程, 是重要的剪接因子。斑马鱼作为重要的模式生物之一, 其基因组中含有人类 WBP11的同源基因 wbp11。为了研究 WBP11在脊椎动物早期发育过程中的作用机制, 利用 CRISPR/Cas9技术构建了斑马鱼 wbp11基因敲除品系。首先, 在 wbp11基因的第二个外显子上设计基因敲除靶位点, 体外转录合成 sgRNA, 通过显微注射技术对斑马鱼进行基因敲除, 得到 F0代嵌合体斑马鱼。随后, 将嵌合体斑马鱼与野生型斑马鱼杂交, 所得到的 F1代斑马鱼进行基因型鉴定, 筛选出其中的杂合子斑马鱼, 并对杂合子斑马鱼的缺失条带进行测序, 结果显示其为 wbp11基因的 2种缺失突变。让同种突变的 F1代杂合子斑马鱼自交, 对得到的后代 F2进行基因型鉴定, 筛选获得了纯合子斑马鱼, 表明 wbp11基因敲除品系构建成功。经显微镜白光成像观察发现, 受精后 48 h的斑马鱼出现心包水肿、心脏线性化、骨骼弯曲畸形, 这可能是由于 wbp11基因突变引起剪接机制异常所导致的。此研究为探究 WBP11基因在脊椎动物的早期发育中的作用机制开辟了道路

H1N1流感病毒属于常见的致病性病毒。流行病学调查研究表明, 新生儿表型缺陷与流感病毒感染有关, 但是具体机制还不明确。为了探讨H1N1流感病毒对胚胎发育的影响, 本文通过流感病毒感染孕母鼠来构建流感病毒宫内感染的动物模型, 分别在胚胎发育至E14.5、E15.5、E16.5、E17.5、E18.5 d以及出生1 d后测量各胚胎的体长, 并在体视镜下观察胚胎体表各血管和器官来分析胚胎外表发育的情况, 然后采用阿尔新蓝-茜素红染色法观察各发育时期胚胎骨骼发育的情况。结果表明, 流感病毒感染的小鼠胚胎的体长明显降低。外部器官发育的差异性可体现在眼、耳等器官, 攻毒组成型稍晚, 尾部异常卷曲更为严重。各骨骼发育攻毒组较对照组更迟缓, 但没有出现长短肢或骨骼缺失等严重异常表型。本研究首次构建了流感病毒宫内感染的动物模型, 探究了H1N1流感病毒对小鼠胚胎表型发育的影响。

已有研究表明RMND5B可能与心肌肥大相关, 但具体机制不明, RMND5B的重组腺病毒载体的构建和鉴定为研究RMND5B功能提供了基础工具。首先, 设计小鼠RMND5B基因的特异性引物, 以cDNA为模板, PCR扩增RMND5B ORF区, 并在两端各加入Hind Ⅲ及SalⅠ的酶切位点。将此片段插入到pMD18-T载体, 再亚克隆至线性化的穿梭质粒pAdTrack-CMV中。PmeⅠ酶切线性化之后, 电转化到含pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌中。在BJ5183细菌中发生同源重组获得了重组质粒pAd-RMND5B质粒。PacⅠ酶切线性化之后转染293A细胞, 经过包装获得腺病毒AdRMND5B。将此腺病毒感染新生大鼠原代心肌细胞, 并在一段时间后观察绿色荧光并通过RT-PCR检测RMND5B的表达情况。结果表明, 成功构建了RMND5B的重组腺病毒载体并实现了AdRMND5B在新生大鼠原代心肌细胞中表达, 为进一步研究RMND5B基因在心肌肥大中的作用奠定了良好的实验基础。

Mesp1属于bHLH转录因子家族, 对早期心脏中胚层的形成十分重要。为研究Mesp1在心脏发育过程中的功能, 本文构建了可诱导表达Mesp1的慢病毒载体, 转染进P19细胞, 经嘌呤霉素筛选并扩大培养后, 成功建立起经强力霉素诱导后可稳定过表达Mesp1基因的细胞系P19-Mesp1, 为研究Mesp1心脏发育相关功能提供有用的细胞研究模型。

制备抗果蝇MRJ蛋白单克隆抗体可用于研究果蝇mrj的生物学功能, 使用IPTG诱导重组质粒pET28a-mrj在大肠杆菌Rosetta中表达, 重组蛋白经过Ni-IDA凝胶柱亲和纯化后免疫BALB/c小鼠。然后取免疫好的小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合, 经克隆和筛选获得了能分泌抗果蝇MRJ蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。腹水制备后获得单克隆抗体, 通过ELISA和Western Blot对所获得的抗体进行鉴定, 结果表明所制备单克隆抗体能够特异性结合于原核及真核细胞表达的MRJ蛋白, 可用于研究mrj基因的生物学功能。

利用RNA干扰技术构建PYGO1基因RNA干扰(RNAi)的真核表达质粒(pSUPER -PYGO1)。首先, 针对 PYGO1 cDNA序列设计并化学合成一对编码短发夹RNA序列, 经退火插入到由BglⅡ 和XhoⅠ酶切的pSUPER 质粒上构建重组RNAi质粒pSUPER-PYGO1。通过XbaⅠ酶切鉴定及测序分析验证构建效果, 将正确构建的质粒转染大鼠心肌细胞系H9c2建立产生逆转录病毒的细胞克隆。通过RT-PCR和Western blot检测pSUPER-PYGO1对H9c2细胞中PYGO1 mRNA和PYGO1蛋白的干扰效果。pSUPER-PYGO1质粒经酶切鉴定及测序分析, 发现59nt寡核苷酸成功插入到预计位点, 且序列完全一致; RT-PCR和Western blot检测结果显示转染 pSUPER-PYGO1的细胞中PYGO1 mRNA和PYGO1蛋白量明显降低。因此, 靶向PYGO1的 pSUPER RNAi 载体构建成功, 为进一步从分子水平探讨PYGO1在心脏发育中的功能奠定了基础。

目的: 利用siRNA 表达载体构建抑制人类成肌发育候选基因ASB12表达的pSUPER RNAi 载体(pSUPER-ASB12), 筛选构建C2C12-pSUPER-ASB12稳定表达细胞系。方法: 化学合成一对编码短发夹RNA序列的、靶向成肌发育候选基因ASB12的寡核苷酸链60个碱基, 退火, 克隆到经BglⅡ、XhoⅠ双酶切的pSUPER 质粒上, 构建重组RNAi质粒(pSUPER-ASB12)。通过酶切鉴定及测序分析检测构建效果。将正确构建的质粒转染小鼠骨骼肌细胞C2C12, 通过G418筛选, 免疫荧光检测, RT-PCR 分析, 建立稳定表达pSUPER-ASB12的细胞系C2C12-pSUPER-ASB12。结果: pSUPER-ASB12载体经酶切鉴定及测序分析, 结果表明60个碱基成功插入到预计位点, 并且序列完全一致。C2C12-pSUPER-ASB12稳定表达细胞系可表达绿色荧光蛋白, RT-PCR检测结果显示C2C12-pSUPER-ASB12细胞中ASB12表达量明显降低。结论: 靶向ASB12的pSUPER RNAi 载体和C2C12-pSUPER-ASB12稳定表达细胞系构建成功, 为进一步从分子水平探讨ASB12在成肌发育中的功能奠定了基础。

odd是一个新发现的心脏特异表达基因。为了进一步研究odd在心脏发育中的功能, 根据已报道的odd基因序列, 以果蝇cDNA文库为模板进行PCR扩增, 将所得的odd部分编码区序列连接到pET-28a载体上构建原核表达载体; 重组子经酶切测序鉴定后, 转化到大肠杆菌BL21菌株, IPTG诱导融合蛋白表达, Ni-IDA凝胶柱亲和纯化, 纯化后的His-odd融合蛋白免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体, Western Blot检测抗体活性。结果表明, 获得了odd原核表达重组融合蛋白以及高效价的、特异性兔抗Odd多克隆抗体, 为后续的odd功能研究奠定了基础。

人类KLHL31基因是本实验室已克隆的基因, 其蛋白质含有保守的BTB和串连重复的Kelch结构域, 实验表明人类KLHL31在成体骨骼肌和心肌组织中特异表达, KLHL31蛋白的过表达可以抑制了AP-1与SRE的活性。本文拟利用阳离子聚合物转染技术将重组表达质粒pCMV-tag2B-KLHL31转染H9c2细胞, 通过G418筛选, RT-PCR和Western blotting验证, 建立稳定过表达KLHL31基因的细胞系H9c2- KLHL31, 为研究KLHL31在心脏发育及其相关功能提供有用的细胞研究模型。

斑马鱼charon基因位于1号染色体上, 其成熟肽编码区含有731 bp, 编码243个氨基酸。charon基因编码Cerberus/Dan家族的一种分泌因子, 它与心脏的左右不对称发育有关。为进一步研究charon在心脏左右不对称发育中的功能, 以斑马鱼为动物模型, 利用RT-PCR的方法成功克隆了斑马鱼charon基因片段, 并将其进行原核表达, 制备了charon多克隆抗体。通过western blotting对抗体进行分析,结果表明: 实验获得了效价较高、特异性较好的charon多克隆抗体,而且charon在斑马鱼中表达较为广泛, 在心脏、肌肉、眼睛等组织表达尤其明显。