人巨细胞病毒(HCMV)是全球范围内普遍感染的一种疱疹病毒, 也是引起胎儿先天性畸形和器官移植受者死亡最常见的病原体。有研究表明,gH蛋白是HCMV主要的中和性抗原, 特异性抗gH抗体具有中和HCMV及阻断病毒在细胞间传播的潜力。本研究以含人巨细胞病毒临床株Toledo全基因组的细菌人工染色体(BAC)为模板, 扩增去除信号肽和跨膜区的gH基因片段, 并将其插入表达载体构建pET32a′-gH重组表达质粒, 将序列鉴定正确的重组质粒转化进入表达菌株TransB, 诱导重组蛋白表达。用纯化的重组gH蛋白免疫8周龄BALB/c雄鼠, 经杂交瘤技术获得5株稳定分泌抗gH单克隆抗体的细胞株, 分别命名为8A9、8B4、8C4、8D9、8D12。所获5株单克隆抗体对gH蛋白均具有良好的反应性, 其中8A9、8B4、8D9和8D12具有一定的病毒捕获能力, 且8D9和8D12的捕获能力较强。本研究获得了具有自主知识产权的抗gH单克隆抗体, 抗体具有良好的病毒捕获能力。在此基础上, 我们将进一步鉴定其是否为中和抗体, 为今后开发治疗HCMV感染的中和抗体奠定基础。

目的: 制备分泌特异性抗人甲状腺球蛋白(thyroglobulin,Tg)单克隆抗体的杂交瘤细胞株, 为建立高灵敏度的Tg检测方法做准备。方法: 以天然人源甲状腺球蛋白为抗原经皮下免疫BALB/c小鼠, 通过细胞融合制备分泌抗人甲状腺球蛋白单克隆抗体, 并对其进行特异性鉴定, 建立检测Tg的双抗体ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)夹心法。结果: 获得7株可稳定分泌抗人甲状腺球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株, 经ELISA鉴定, 筛选抗体可与Tg抗原有良好的特异性反应。建立的双抗体夹心ELISA方法敏感性可达1 ng/mL。 结论: 成功制备了抗人Tg单克隆抗体并建立了检测人Tg双抗体夹心ELISA方法, 为进一步研发Tg快速诊断试剂盒提供了原料。

目的: 高效表达与纯化可溶性重组人PCT蛋白, 制备高灵敏度和高特异性的抗人PCT医用诊断单克隆抗体。 方法: 大肠杆菌表达重组人PCT蛋白后, 利用饱和硫酸铵沉淀和亲和层析方法纯化PCT蛋白后, 经质谱、Western blot和间接 ELISA法进行性质鉴定和分析重组蛋白的表达与免疫反应性; 重组蛋白免疫小鼠, 经细胞融合及筛选制备抗PCT单克隆抗体(mAb)。 结果:在大肠杆菌中高效表达了人PCT蛋白; 重组人PCT蛋白具有良好的免疫反应性与免疫原性; 经筛选获得7株抗PCT单克隆抗体细胞株, 经ELISA鉴定, 筛选抗体可与PCT抗原有良好的特异性反应。 结论: 利用重组人PCT蛋白免疫制备了抗人PCT单克隆抗体, 为进一步研发PCT快速诊断试剂提供了原料。

人类巨细胞病毒(Human cytomegalovirus, HCMV)是一种机会性感染疱疹病毒, 在人群中感染比较常见, 但在免疫缺陷个体与新生儿中可引起严重的疾病。HCMV Pp65是HCMV活动感染的主要标志, 也是临床检验检测HCMV感染的重要靶标。为研发抗HCMV Pp65蛋白单克隆抗体作为临床免疫检测HCMV感染的关键原料, 本研究采用重组表达的HCMV Pp65蛋白免疫BALB/c小鼠, 将免疫小鼠淋巴结细胞与sp2/0细胞融合, 采用间接ELISA法筛选阳性克隆与效价测定, 再用Western blotting 进行抗体特异性鉴定, 最后用免疫捕获PCR和免疫荧光法评价其应用前景。最终获得了1株能稳定分泌高效价的抗HCMV Pp65单克隆抗体的杂交瘤细胞株, 命名为8D6。Western blotting及间接ELISA检测其效价分别达1∶4 000 和1∶105; 细胞免疫荧光与免疫捕获PCR实验结果说明, 该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有良好的亲和力和特异性, 具有作为外周血细胞免疫荧光细胞化学和免疫捕获PCR检测HCMV临床感染的关键原料, 也可作为双抗体夹心法检测HCMV临床感染的关键原料, 为建立HCMV感染快速灵敏的临床诊断试剂打下了重要的基础。

制备抗果蝇MRJ蛋白单克隆抗体可用于研究果蝇mrj的生物学功能, 使用IPTG诱导重组质粒pET28a-mrj在大肠杆菌Rosetta中表达, 重组蛋白经过Ni-IDA凝胶柱亲和纯化后免疫BALB/c小鼠。然后取免疫好的小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合, 经克隆和筛选获得了能分泌抗果蝇MRJ蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。腹水制备后获得单克隆抗体, 通过ELISA和Western Blot对所获得的抗体进行鉴定, 结果表明所制备单克隆抗体能够特异性结合于原核及真核细胞表达的MRJ蛋白, 可用于研究mrj基因的生物学功能。

为获得分泌抗人β-actin蛋白单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞, 通过在大肠杆菌中原核表达人β-actin蛋白, 以纯化的人β-actin蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠。经过细胞的融合及筛选获得1株能稳定分泌抗人β-actin蛋白McAb的杂交瘤细胞, 命名为2B4。采用间接ELISA和Western blot方法对McAb的特异性、稳定性和适用范围进行鉴定。结果显示: 蛋白的相对分子质量为43 kDa, 可溶于8 mol/L尿素; 杂交瘤细胞上清的抗体效价为1×105, 腹水的抗体效价为1×107; 间接ELISA结果表明, 杂交瘤细胞在体外传20代或液氮冻存3个月后, 分泌的抗体效价不变; 37 ℃保存24 h后, 抗体的效价开始下降。Western blot结果显示, 单克隆抗体识别人、鼠、兔和鱼的β-actin蛋白, 与其发生特异性反应。2B4分泌的单克隆抗体可以广泛的应用于细胞生物学和免疫学试验, 具有良好的应用价值。

Background and Aims: Accurate endoscopic detection of premalignant lesions and early cancers in the colon is essential for cure, since prognosis is closely related to lesion size and stage. Although it has great clinical potential, autofluorescence endoscopy has limited tumorto- normal tissue image contrast for detecting small preneoplastic lesions. We have developed a molecularly specific, near-infrared fluorescent monoclonal antibody (CC49) bioconjugate which targets tumor-associated glycoprotein 72 (TAG72), as a contrast agent to improve fluorescencebased endoscopy of colon cancer. Methods: The fluorescent anti-TAG72 conjugate was evaluated in vitro and in vivo in athymic nude mice bearing human colon adenocarcinoma (LS174T) subcutaneous tumors. Autofluorescence, a fluorescent but irrelevant antibody and the free fluorescent dye served as controls. Fluorescent agents were injected intravenously, and in vivo whole body fluorescence imaging was performed at various time points to determine pharmacokinetics, followed by ex vivo tissue analysis by confocal fluorescence microscopy and histology. Results: Fluorescence microscopy and histology confirmed specific LS174T cell membrane targeting of labeled CC49 in vitro and ex vivo. In vivo fluorescence imaging demonstrated significant tumor-to-normal tissue contrast enhancement with labeled-CC49 at three hours post injection, with maximum contrast after 48 h. Accumulation of tumor fluorescence demonstrated that modification of CC49 antibodies did not alter their specific tumor-localizing properties, and was antibody-dependent since controls did not produce detectable tumor fluorescence. Conclusions: These results show proof-of-principle that our near-infrared fluorescent-antibody probe targeting a tumor-associated mucin detects colonic tumors at the molecular level in real time, and offer a basis for future improvement of image contrast during clinical fluorescence endoscopy.

肿瘤靶向治疗的研究是当今生物医学界的研究热点。寻找具有肿瘤靶向性的高效体内运输载体是实现肿瘤靶向治疗的关键。采用整合素αvβ3单克隆抗体作为肿瘤靶向分子, 以单壁碳纳米管(SWNT)作为运输载体, 通过碳纳米管表面的适当功能化, 将整合素αvβ3单抗标记在碳纳米管上, 构建整合素αvβ3单抗标记的碳纳米管新型肿瘤靶向探针; 研究探针在人脐静脉内皮细胞HUVEC和整合素αvβ3高表达的人脑神经胶质瘤细胞U87MG的肿瘤靶向性。实验结果表明, 这种整合素αvβ3单抗标记的碳纳米管探针对U87MG细胞靶向选择性高, 将能成为一种有潜力的药物输送及肿瘤分子影像的新型肿瘤靶向载体。