用KLH偶联合成细胞角蛋白7(CK7)优势表位多肽片段(C14)免疫小鼠, 经细胞融合技术制备CK7单克隆抗体(mAb), 并收集临床组织进行免疫组化鉴定。C14多肽作为抗原具有良好的免疫反应性。本研究共获得了3株能稳定分泌抗CK7抗体的单克隆细胞株, 选择亲和力较好的7A8单克隆抗体进行免疫组化鉴定, 结果表明, 本研究筛选的7A8单克隆抗体的质量浓度为0.49 μg/mL时, 与收集的临床标本均有良好的特异性反应, 低于医院常用CK7检测试剂盒中抗体质量浓度2～5?μg/mL, 表现出较高的灵敏度。本研究筛选的7A8单克隆抗体为研发CK7快速诊断试剂提供了关键的原材料。

干细胞治疗作为某些难治性疾病的新型治疗手段, 在组织修复、自身免疫疾病和退行性疾病治疗中具有重要的临床价值。本研究以裸鼠为动物模型, 通过裸鼠皮下成瘤、克隆形成和端粒酶活性等试验, 评估人脐带间充质干细胞的安全性, 为干细胞用于临床治疗的安全性提供参考。裸鼠成瘤性试验结果显示, 阴性对照组和试验组成瘤数均为0, 阳性对照组成瘤数为12。克隆形成试验结果显示, 阴性对照组和试验组无克隆形成, 阳性对照组有克隆形成。端粒酶活性测定结果显示, 阴性对照组端粒酶相对活性为0.01, 阳性对照组端粒酶相对活性为4.33, 试验组 P6代细胞端粒酶相对活性为1.70。因此, 本研究的评估结果显示, 人脐带间充质干细胞在裸鼠中不致瘤, 克隆形成试验结果为阴性, 端粒酶活性测定结果正常, 具有良好的遗传稳定性。人脐带间充质干细胞在本试验中展现了良好的安全性, 具有较好的临床应用价值。

人巨细胞病毒(HCMV)感染是常见的病毒性疾病, 目前无有效的疫苗, 故抗病毒药物筛选对HCMV的治疗具有重要意义。为了构建一种抗巨细胞病毒体外药物快速筛选模型, 本研究以带有荧光素酶标签的鼠巨细胞病毒细菌人工染色体(Luc-MCMV-BAC)为基础, 将其转染至小鼠成纤维细胞NIH-3T3, 成功获得重组病毒Luc-MCMV, 且其能够在细胞中稳定发光。噬斑法测定的病毒生长曲线显示, Luc-MCMV与野生型病毒Wt-MCMV具有相似的生长动力学, 说明Luc-MCMV 能够反映Wt-MCMV的生长状况, 可用于后续抗病毒药物的筛选评价。进一步选用更昔洛韦(Ganciclovir)作为阳性对照药物, 应用该体系对6种中药单体进行了筛选, 结果显示黄芩素和黄芪甲苷具有抗MCMV活性, 为抗HCMV药物的筛选奠定了前期基础。

人巨细胞病毒(HCMV)是全球范围内普遍感染的一种疱疹病毒, 也是引起胎儿先天性畸形和器官移植受者死亡最常见的病原体。有研究表明,gH蛋白是HCMV主要的中和性抗原, 特异性抗gH抗体具有中和HCMV及阻断病毒在细胞间传播的潜力。本研究以含人巨细胞病毒临床株Toledo全基因组的细菌人工染色体(BAC)为模板, 扩增去除信号肽和跨膜区的gH基因片段, 并将其插入表达载体构建pET32a′-gH重组表达质粒, 将序列鉴定正确的重组质粒转化进入表达菌株TransB, 诱导重组蛋白表达。用纯化的重组gH蛋白免疫8周龄BALB/c雄鼠, 经杂交瘤技术获得5株稳定分泌抗gH单克隆抗体的细胞株, 分别命名为8A9、8B4、8C4、8D9、8D12。所获5株单克隆抗体对gH蛋白均具有良好的反应性, 其中8A9、8B4、8D9和8D12具有一定的病毒捕获能力, 且8D9和8D12的捕获能力较强。本研究获得了具有自主知识产权的抗gH单克隆抗体, 抗体具有良好的病毒捕获能力。在此基础上, 我们将进一步鉴定其是否为中和抗体, 为今后开发治疗HCMV感染的中和抗体奠定基础。

本文主要对大鼠、小鼠盲肠结扎穿刺术(CLP)脓毒血症模型进行分析, 从模式动物角度发现潜在的脓毒血症相关基因, 为脓毒血症诊疗提供理论依据。从NCBI-Gene Expression Omnibus数据库下载原始微阵列数据集, 然后纳入盲肠结扎穿刺术脓毒血症及假手术组模型数据。运用生物信息学方法将数据标准化处理后, 筛选差异基因进行富集分析和通路分析, 并构建蛋白质相互作用关系网络, 筛选出具有重要生理调节功能的核心蛋白质和关键候选基因。通过大鼠盲肠穿刺脓毒血症诱导后肝组织的差异基因表达芯片筛选, 共获得350个能上调1.5倍及以上的差异基因, 1 337个能下调2倍及以上的差异基因; 通过小鼠盲肠穿刺脓毒血症诱导后肝组织的差异基因表达芯片筛选, 获得3 532个上调1.5倍及以上的差异基因, 4 020个下调1.5倍及以上的差异基因; 对上述芯片结果的差异基因取交集, 得到29个共同上调表达1.5倍以上的差异基因和84个共同下调表达1.5倍以上的差异基因。利用String数据库对上述基因进行蛋白质-蛋白质的相互作用(PPI)网络分析, 并利用David数据库从生物过程(BP)、分子功能(MF)、细胞组分(CC)和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路4个角度进行基因功能分析, 发现共有10条通路与脓毒血症肝组织关系密切, 其中最主要的通路为丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路, 其次, 缺氧诱导因子1(HIF-1)、叉形头转录因子的O亚型(FoxO)、乙型肝炎、血小板激活及胆汁分泌等通路调控也与脓毒血症相关。本研究为进一步探讨脓毒血症相关病理生理机制及诊疗方法提供了理论基础。

目的: 制备分泌特异性抗人甲状腺球蛋白(thyroglobulin,Tg)单克隆抗体的杂交瘤细胞株, 为建立高灵敏度的Tg检测方法做准备。方法: 以天然人源甲状腺球蛋白为抗原经皮下免疫BALB/c小鼠, 通过细胞融合制备分泌抗人甲状腺球蛋白单克隆抗体, 并对其进行特异性鉴定, 建立检测Tg的双抗体ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)夹心法。结果: 获得7株可稳定分泌抗人甲状腺球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株, 经ELISA鉴定, 筛选抗体可与Tg抗原有良好的特异性反应。建立的双抗体夹心ELISA方法敏感性可达1 ng/mL。 结论: 成功制备了抗人Tg单克隆抗体并建立了检测人Tg双抗体夹心ELISA方法, 为进一步研发Tg快速诊断试剂盒提供了原料。

为分析不同饲料喂养对黄牛胃中微生物群落结构的影响, 分别用芒草单一喂养和农家混合饲料喂养两年的黄牛为实验组和对照组。以瘤胃、蜂巢胃、重瓣胃和皱胃四个胃中的微生物为研究对象,采用原位包埋裂解法和脉冲场电泳（pulsed field gel electrophoresis, PFGE）提取微生物总DNA, 脉冲场电泳（pulsed field gel electrophoresis, PFGE）。使用细菌16S rRNA引物341F/534R及真菌18S rDNA引物NS1/GCFungi进行降落PCR扩增。变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE）对扩增产物进行区分,使用硝酸银染色。电泳扫描结果通过Quantity one软件进行分析, SPSS软件进行数据统计。针对实验组和对照组瘤胃样品共性条带和特性条带测序并比对。结果表明: 实验组与对照组细菌群落结构变化较大, UPGAM聚类图上被分为两支, 相似性只有0.35。且香农多样性指数及条带丰度都明显少于对照组。真菌DGGE图谱条带差别不大, 聚类图上显示实验组四个样品与对照组四个样品相似性在0.43～0.68之间。多样性及条带丰度在实验组与对照组之间差异0.0027～0.5999。测序结果, 细菌与数据库中未培养细菌种类较为接近, 而真菌中部分与已知菌种接近。芒草单一饲养对牛胃中的微生物群落结构具有极大的影响, 对细菌的影响尤为明显。

目的: 高效表达与纯化可溶性重组人PCT蛋白, 制备高灵敏度和高特异性的抗人PCT医用诊断单克隆抗体。 方法: 大肠杆菌表达重组人PCT蛋白后, 利用饱和硫酸铵沉淀和亲和层析方法纯化PCT蛋白后, 经质谱、Western blot和间接 ELISA法进行性质鉴定和分析重组蛋白的表达与免疫反应性; 重组蛋白免疫小鼠, 经细胞融合及筛选制备抗PCT单克隆抗体(mAb)。 结果:在大肠杆菌中高效表达了人PCT蛋白; 重组人PCT蛋白具有良好的免疫反应性与免疫原性; 经筛选获得7株抗PCT单克隆抗体细胞株, 经ELISA鉴定, 筛选抗体可与PCT抗原有良好的特异性反应。 结论: 利用重组人PCT蛋白免疫制备了抗人PCT单克隆抗体, 为进一步研发PCT快速诊断试剂提供了原料。

人类巨细胞病毒(Human cytomegalovirus, HCMV)是一种机会性感染疱疹病毒, 在人群中感染比较常见, 但在免疫缺陷个体与新生儿中可引起严重的疾病。HCMV Pp65是HCMV活动感染的主要标志, 也是临床检验检测HCMV感染的重要靶标。为研发抗HCMV Pp65蛋白单克隆抗体作为临床免疫检测HCMV感染的关键原料, 本研究采用重组表达的HCMV Pp65蛋白免疫BALB/c小鼠, 将免疫小鼠淋巴结细胞与sp2/0细胞融合, 采用间接ELISA法筛选阳性克隆与效价测定, 再用Western blotting 进行抗体特异性鉴定, 最后用免疫捕获PCR和免疫荧光法评价其应用前景。最终获得了1株能稳定分泌高效价的抗HCMV Pp65单克隆抗体的杂交瘤细胞株, 命名为8D6。Western blotting及间接ELISA检测其效价分别达1∶4 000 和1∶105; 细胞免疫荧光与免疫捕获PCR实验结果说明, 该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有良好的亲和力和特异性, 具有作为外周血细胞免疫荧光细胞化学和免疫捕获PCR检测HCMV临床感染的关键原料, 也可作为双抗体夹心法检测HCMV临床感染的关键原料, 为建立HCMV感染快速灵敏的临床诊断试剂打下了重要的基础。

为获得分泌抗人β-actin蛋白单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞, 通过在大肠杆菌中原核表达人β-actin蛋白, 以纯化的人β-actin蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠。经过细胞的融合及筛选获得1株能稳定分泌抗人β-actin蛋白McAb的杂交瘤细胞, 命名为2B4。采用间接ELISA和Western blot方法对McAb的特异性、稳定性和适用范围进行鉴定。结果显示: 蛋白的相对分子质量为43 kDa, 可溶于8 mol/L尿素; 杂交瘤细胞上清的抗体效价为1×105, 腹水的抗体效价为1×107; 间接ELISA结果表明, 杂交瘤细胞在体外传20代或液氮冻存3个月后, 分泌的抗体效价不变; 37 ℃保存24 h后, 抗体的效价开始下降。Western blot结果显示, 单克隆抗体识别人、鼠、兔和鱼的β-actin蛋白, 与其发生特异性反应。2B4分泌的单克隆抗体可以广泛的应用于细胞生物学和免疫学试验, 具有良好的应用价值。