黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的心脏发育调控基因与人类的相关基因具有高度同源性。Lbe基因是果蝇心脏发育的重要调控基因。为了深入研究Lbe基因在心脏发育中的调控功能, 采用DNA免疫技术制备了抗果蝇Lbe蛋白的多克隆抗体。通过PCR扩增Lbe基因序列, 将该序列与真核表达载体pCAGGS-P7同源重组, 以该同源重组载体免疫4周龄小鼠, 获得含有抗Lbe多克隆抗体的血清。蛋白质印迹(Western blot)和胚胎抗体染色结果表明, 该抗体的特异性较好。该抗体为随后的Lbe功能的研究奠定了基础。

Asb11基因被报道与斑马鱼Notch信号的激活有关,本研究室过去的研究显示该基因在心肌和骨骼肌中特异性表达。因此推测Asb11基因可能是心脏发育相关候选基因。为了阐明Asb11基因在斑马鱼心脏发育过程中的作用,本文利用CRISPR/Cas9打靶技术构建敲除Asb11基因的斑马鱼品系。首先在线分析筛选出Asb11基因最适合的打靶位点,然后PCR扩增出Asb11基因gRNA的双链cDNA,再将Asb11基因的gRNA和Hcas9的mRNA共同注射到斑马鱼胚胎Ⅰ细胞期胚胎中。进行打靶的有效性检测,发现Asb11基因的一号外显子出现了碱基的缺失,表明CRISPR/Cas9 系统对Asb11基因的敲除是有效的。对其F0代、F1代、F2代进行筛选,成功获得了Asb11基因敲除的斑马鱼品系,为探究Asb11在心脏发育中的作用奠定了基础。

CRISPR/Cas9基因打靶技术是近几年发展起来的一种高效率的定向打靶技术, 被认为是遗传领域的革命性技术。Titin-Cap基因是本实验室已初步鉴定的斑马鱼心脏发育候选基因, 且国内外目前尚无斑马鱼Titin-Cap基因的敲除品系。为了研究Titin-Cap基因在心脏发育过程中的作用机制, 我们利用CRISPR/Cas9基因打靶技术建立斑马鱼Titin-Cap基因的敲除品系。测序结果显示, 注射了CRISPR/Cas9 gRNA的胚胎出现双峰, 说明在打靶位点附近出现了碱基缺失或插入, 证明我们设计的gRNA是有效的。对F0代突变体成鱼的筛选中, 测序结果同样显示有阳性结果。这些结果说明用CRISPR/Cas9基因打靶技术成功敲除了斑马鱼Titin-Cap基因, 获得了Titin-Cap基因敲除的嵌合体斑马鱼。

为了在动物体内研究Fbxl5基因是通过什么机制导致斑马鱼心脏出现突变表型, 本文利用近几年兴起的CRISPR/Cas9打靶技术建立斑马鱼Fbxl5基因敲除品系。本文将打靶位点定位于Fbxl5的F-box结构域, 也就是Fbxl5的第五号外显子上。首先经过基因打靶网站分析筛选出针对Fbxl5基因F-box结构域最适合的打靶位点, 扩增出Fbxl5基因CRISPR/Cas9打靶双链DNA, 并转录为RNA, 与Hcas9共注射至斑马鱼胚胎。最后, 在注射48 h后对Fbxl5基因CRISPR/Cas9打靶的有效性进行检测。首先在注射48 h之后收集胚胎提取基因组DNA, 用特异性引物进行PCR扩增; 将纯化后的Fbxl5基因PCR产物连接到pMD18-T载体, 再经质粒提取, 测序分析, 通过与WT斑马鱼基因组序列进行比对发现Fbxl5-9号在PAM序列AGG下游缺失了4个碱基。证明该CRISPR/Cas9 系统在敲除心脏发育候选基因Fbxl5是有效的, 该研究为最终获得Fbxl5基因敲除斑马鱼奠定了良好的基础。

TALEN(transcription activator-like effector nuclease)打靶是一种定向敲除基因技术, 利用该技术能解决目前在斑马鱼体内难以进行基因敲除的难题。Klhl31是本实验室鉴定的人类心脏发育候选基因, 且目前国内外尚无斑马鱼Klhl31敲除品系。为了在斑马鱼的整体水平鉴定Klhl31的生物学功能, 我们利用TALEN打靶技术建立斑马鱼Klhl31基因敲除品系。酶切验证的结果显示, 注射了TALEN表达质粒的胚胎在酶切位点处发生了基因突变, 该突变破坏了酶切位点导致酶切出现阳性结果, 证明了TALEN打靶的有效性。对F0代突变体成鱼的筛选过程中, 经酶切验证, 同样出现了阳性结果。这些结果说明用TALEN这种技术成功敲除了斑马鱼Klhl31基因, 获得了Klhl31基因敲除的嵌合体斑马鱼。

研究工作者们一直致力于寻找一种在模式生物中进行精确基因修饰的方法。近期基于TALENs的基因打靶方法受到广泛的注意, 并在包括果蝇、斑马鱼、小鼠及人类多潜能细胞的多物种中取得成功。在这里, 我主要介绍基于TALENs的基因修饰在果蝇模型中的应用以及果蝇心脏发育候选基因Yippee的敲除。首先, 我们设计并拼接好了Yippee基因的TALENs靶位点序列, 连接在核酸酶Xmn I的催化区域。在核酸酶的作用下产生双链的断裂, 随后在非同源末端连接物修复系统(NHEJ)的修复下导致Yippee基因的消除或部分缺失。经过检测, 得到Yippee基因的TALENs打靶效率约为9%。

Bzw2(basic leucine zipper and W2 domains 2)基因是人类心脏发育候选基因, 它由bzip结构域和W2结构域构成。为了研究该基因在心脏发育过程中的作用, 利用生物信息学信息克隆了人类Bzw2基因全长, 将所得的片段插入到原核表达载体pGEXT-4T-1 载体中, 利用BL21菌株表达该重组质粒, 经过IPTG诱导, 得到GST-Bzw2融合蛋白, 蛋白经纯化分离后免疫新西兰大白兔, 并用Western blotting 检测抗体效价。利用抗体进行了心脏, 肌肉, 脑组织表达检测, 结果显示, Bzw2在心脏, 肌肉, 脑组织中高表达。

CXXC5基因是从人类胚胎心脏的cDNA文库中克隆出来的一个人类锌指基因, 包含zf-CXXC5结构域, 该基因编码322个氨基酸, 在物种进化上高度保守。为了进一步研究该基因的功能, 需要获得CXXC5蛋白并制备其抗体.通过PCR扩增方法扩增得到了CXXC5部分编码区序列, 然后将其连接到PGEX-4T-1 上, 转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中, 再通过自身诱导法诱导表达重组质粒的融合蛋白. 通过割胶回收纯化融合蛋白。免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体, Western blot 检测抗体活性。结果表明, 实验获得了高质量的多克隆抗体。

斑马鱼心脏发育模型中Nodal编码转录因子调节心脏的左右不对称发育, 为了进一步研究Nodal信号途径在心脏发育中的调控作用和心脏疾病发生的分子机制, 需要获得斑马鱼Nodal蛋白并制备其抗体。采用从斑马鱼心脏组织中提取RNA, 通过反转录得到心脏组织各种表达基因的cDNA为模板, PCR扩增得到Nodal部分编码区序列,然后将其连接到pET-28a载体上获得原核表达。经酶切及测序鉴定后, 转化Rosseta细菌, 并用IPTG诱导表达融合蛋白, Ni-IDA凝胶柱亲和纯化, 将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体, 并用Western blotting检测抗体。获得了Nodal原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Nodal多克隆抗体, 为Nodal功能的进一步研究奠定了基础。

Lefty蛋白是TGFβ大家族的配体, 通过与Nodal以及Nodal的受体结合而抑制Nodal信号转导。本文采用PCR技术扩增出斑马鱼lefty1基因(z-lefty1)的部分编码区, 将其插入到pGEX-4T-1原核表达载体中。所构建的重组质粒(pGEX/z-Lefty1) 转化入BL21大肠杆菌, 通过IPTG诱导表达GST-z-Lefty1融合蛋白。蛋白经尿素洗涤分离后用于免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体。Western blotting检测结果表明获得了高效价的特异性兔抗z-Lefty1多克隆抗体。这为进一步研究斑马鱼心脏发育的分子机制创造了条件。