心脏神经脊衍生物表达转录因子2(Hand2)是bHLH家族的成员, 也称为dHand、Hed和Thing2, 可在人以及鼠、鸡、斑马鱼、果蝇等模式动物中表达。国内外的研究显示, Hand2主要影响右心室的发育, 在维持右心室祖细胞和右心室形态发生中起关键作用。为了进一步研究Hand2基因参与心脏发育的作用机制, 拟通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建斑马鱼Hand2基因敲除品系。根据生物信息学网站的分析筛选出最优的两个靶位点, 设计并合成引物, 利用PCR扩增得到Hand2基因sgRNA的cDNA, 再转录为mRNA, 将两个靶位点sgRNA的mRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼胚胎的Ⅰ-细胞期。在斑马鱼的胚胎和成鱼时期进行基因敲除的有效性检测, 发现在靶位点附近有碱基的缺失和插入, 表明CRISPR/Cas9对斑马鱼Hand2基因敲除是有效的。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了斑马鱼的Hand2基因敲除模型, 为后期研究Hand2基因在人类疾病中的作用机制和新型治疗靶点的临床开发等奠定了基础。

研究果蝇的心脏发育基因表达调控机制, 其相应靶点的抗体必不可少。但目前市场上缺乏此类商用抗体, 因此本研究选择果蝇心脏发育中的标记基因Svp(Seven-up), 并采用DNA免疫技术来快速制备其抗体。首先通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出Svp基因编码区部分序列, 然后将其连接到真核表达载体pCAGGS-P7上, 再将重组质粒pCAGGS-P7-Svp直接注射进小鼠体内, 使外源基因在活体内表达, 产生的抗原激活了小鼠的特异性细胞免疫和体液免疫, 从而分泌相应的抗体, 取小鼠的血清收集获得抗体。最后用蛋白质印迹(Western blot)和胚胎免疫荧光技术检测Svp抗体的效价和特异性。结果表明, 制备的Svp多克隆抗体具有高效价和特异性, 为后续的果蝇心脏发育研究奠定了基础。

TALEN(transcription activator-like effector nuclease)打靶是一种定向敲除基因技术, 利用该技术能解决目前在斑马鱼体内难以进行基因敲除的难题。Klhl31是本实验室鉴定的人类心脏发育候选基因, 且目前国内外尚无斑马鱼Klhl31敲除品系。为了在斑马鱼的整体水平鉴定Klhl31的生物学功能, 我们利用TALEN打靶技术建立斑马鱼Klhl31基因敲除品系。酶切验证的结果显示, 注射了TALEN表达质粒的胚胎在酶切位点处发生了基因突变, 该突变破坏了酶切位点导致酶切出现阳性结果, 证明了TALEN打靶的有效性。对F0代突变体成鱼的筛选过程中, 经酶切验证, 同样出现了阳性结果。这些结果说明用TALEN这种技术成功敲除了斑马鱼Klhl31基因, 获得了Klhl31基因敲除的嵌合体斑马鱼。

Mesp1属于bHLH转录因子家族, 对早期心脏中胚层的形成十分重要。为研究Mesp1在心脏发育过程中的功能, 本文构建了可诱导表达Mesp1的慢病毒载体, 转染进P19细胞, 经嘌呤霉素筛选并扩大培养后, 成功建立起经强力霉素诱导后可稳定过表达Mesp1基因的细胞系P19-Mesp1, 为研究Mesp1心脏发育相关功能提供有用的细胞研究模型。

研究工作者们一直致力于寻找一种在模式生物中进行精确基因修饰的方法。近期基于TALENs的基因打靶方法受到广泛的注意, 并在包括果蝇、斑马鱼、小鼠及人类多潜能细胞的多物种中取得成功。在这里, 我主要介绍基于TALENs的基因修饰在果蝇模型中的应用以及果蝇心脏发育候选基因Yippee的敲除。首先, 我们设计并拼接好了Yippee基因的TALENs靶位点序列, 连接在核酸酶Xmn I的催化区域。在核酸酶的作用下产生双链的断裂, 随后在非同源末端连接物修复系统(NHEJ)的修复下导致Yippee基因的消除或部分缺失。经过检测, 得到Yippee基因的TALENs打靶效率约为9%。

lbe是已经证明的心脏标记基因。为了深入研究lbe在心脏发育中的功能, 需要获得lbe蛋白并制备其抗体。首先提取野生型成体果蝇的总RNA, 反转录获得其cDNA文库, 通过PCR克隆出lbe编码区序列, 将其连接到pET-28a原核表达载体上。经酶切及测序鉴定后, 质粒构建成功。将重组质粒(pET-28a-lbe)转化大肠杆菌菌株Rosseta,用IPTG诱导表达出融合蛋白, 经Ni-IDA凝胶柱纯化后, 最后将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备lbe多克隆抗体,并用Western blotting检测抗体的效价和特异性。结果显示获得了lbe原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗lbe多克隆抗体, 为lbe功能的进一步研究奠定了基础。

制备果蝇心脏标记基因Hand抗体对研究果蝇心脏发育具有重要意义。从果蝇体内提取出总RNA, 反转录得到果蝇的cDNA, 将其作为模板PCR得到Hand基因部分片段, 将片段连接到pET-28a上, 构建重组质粒pET-28a-Hand, 将重组质粒转化rosetta受体菌, IPTG诱导表达, 表达产物经镍柱纯化, SDS-PAGE 电泳分析, 结果表明Hand基因在大肠杆菌中成功表达, 表达的Hand融合蛋白分子量大约为24 kD, 经镍柱纯化后获得了高纯度可溶性的Hand蛋白。

odd是一个新发现的心脏特异表达基因。为了进一步研究odd在心脏发育中的功能, 根据已报道的odd基因序列, 以果蝇cDNA文库为模板进行PCR扩增, 将所得的odd部分编码区序列连接到pET-28a载体上构建原核表达载体; 重组子经酶切测序鉴定后, 转化到大肠杆菌BL21菌株, IPTG诱导融合蛋白表达, Ni-IDA凝胶柱亲和纯化, 纯化后的His-odd融合蛋白免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体, Western Blot检测抗体活性。结果表明, 获得了odd原核表达重组融合蛋白以及高效价的、特异性兔抗Odd多克隆抗体, 为后续的odd功能研究奠定了基础。

CXXC5基因是从人类胚胎心脏的cDNA文库中克隆出来的一个人类锌指基因, 包含zf-CXXC5结构域, 该基因编码322个氨基酸, 在物种进化上高度保守。为了进一步研究该基因的功能, 需要获得CXXC5蛋白并制备其抗体.通过PCR扩增方法扩增得到了CXXC5部分编码区序列, 然后将其连接到PGEX-4T-1 上, 转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中, 再通过自身诱导法诱导表达重组质粒的融合蛋白. 通过割胶回收纯化融合蛋白。免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体, Western blot 检测抗体活性。结果表明, 实验获得了高质量的多克隆抗体。

斑马鱼心脏发育模型中Nodal编码转录因子调节心脏的左右不对称发育, 为了进一步研究Nodal信号途径在心脏发育中的调控作用和心脏疾病发生的分子机制, 需要获得斑马鱼Nodal蛋白并制备其抗体。采用从斑马鱼心脏组织中提取RNA, 通过反转录得到心脏组织各种表达基因的cDNA为模板, PCR扩增得到Nodal部分编码区序列,然后将其连接到pET-28a载体上获得原核表达。经酶切及测序鉴定后, 转化Rosseta细菌, 并用IPTG诱导表达融合蛋白, Ni-IDA凝胶柱亲和纯化, 将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体, 并用Western blotting检测抗体。获得了Nodal原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Nodal多克隆抗体, 为Nodal功能的进一步研究奠定了基础。