利用改良后的Percoll连续密度梯度分离方法,分离不同酵母菌株稳定期的同步细胞,并在单细胞水平上,应用激光光镊拉曼光谱对分离的同步细胞进行鉴别.采用高速离心机角式转头和2　mL聚丙烯离心管,20　℃,19　320　g离心15 min,将大约1.75　mL Percoll溶液形成1.00~1.31　g·mL-1连续密度梯度;将样品均匀铺加在离心管连续密度梯度液顶层,20　℃,400　g离心60 min,酵母分成明显的2层细胞带;微分干涉差显微镜(DIC)、相差显微镜以及同步生长曲线分析显示,下层酵母细胞以单个细胞为主,大小均匀、致密,折光性强,生长呈现阶梯式增长,具有同步细胞生长的特性,确定其为同步的G0细胞.利用单细胞光镊拉曼光谱系统对所分离的G0同步细胞与非G0细胞进行分析,结果显示G0同步细胞和非G0细胞的特征峰位置基本一致,但G0细胞对应的蛋白质、糖类、核酸等生物大分子特征峰强度大于非G0细胞,说明G0细胞大分子物质含量要比非G0细胞的高;对G0细胞和非G0细胞进行主成分分析,结果显示,分离的同步化G0细胞之间成分含量差异少,比较均一,而非同步细胞之间内含物质差异大,呈不均一性,说明单细胞光镊拉曼光谱系统可以鉴别同步和非同步细胞.改良后的Percoll连续密度梯度分离方法,能够分离多数酵母菌株同步化细胞,是一种易操作、成本低、效率高的细胞分离方法.

pH值是影响酵母乙醇发酵的重要因素。应用拉曼光谱初步分析不同初始pH值对乙醇发酵过程的影响。结果显示：1) 在3.0、4.5、6.5三个不同初始pH值的培养基中，pH 4.5下乙醇产量最高，pH 3.0下最低。2) 在发酵的前15 h，不同初始pH值下的酵母细胞生物大分子的拉曼信号变化波动大；后期，pH 3.0下胞内脂类和蛋白质的拉曼信号最强，pH 6.5最弱；显示在低pH值环境下部分底物可能被转化为胞内储藏物质。3) 主成分分析显示，pH值对酵母细胞生理状态的影响从发酵的初始阶段就开始；1440 cm-1和1600 cm-1峰一直是影响主成分PC1、PC2、PC3分值的主要特征峰；说明pH环境可能影响了酵母细胞的脂类物质合成和细胞的呼吸代谢，进而影响了底物的代谢方向和产物的合成。结果表明，拉曼光谱和单细胞分析可以用于剖析微生物发酵过程的生理机制，为乙醇发酵提供全新的参考信息。

应用激光镊子拉曼光谱技术收集500 L发酵罐中木薯淀粉浓醪乙醇发酵过程底物、产物及酵母单细胞的拉曼光谱，以期从单细胞水平为乙醇发酵提供新的认识。结果显示：1)拉曼光谱可以实时监测浓醪乙醇发酵过程底物与产物的变化；2）酵母细胞胞内物质的变化存在类似于产物变化的前发酵期、主发酵期和后发酵期3个阶段，但出现的时间要比产物变化晚约4 h；3）为适应浓醪发酵环境，酵母细胞的生理状态和胞内物质在不断地进行调整，随着环境乙醇浓度的升高，酵母细胞在胞内累积蛋白质和脂类物质，蛋白质二级结构逐渐变为以无规则卷曲为主；4）发酵后期，酵母细胞在胞内累积大量的嘌呤类物质，但细胞间含量存在异质性。上述结果表明，单细胞拉曼光谱技术提供了一种研究微生物发酵的新方法，可从新的角度获知乙醇发酵过程酵母细胞内外的变化信息。

应用单细胞拉曼光谱技术结合多元统计方法分析比较了六株不同来源的酿酒酵母菌株的同步化细胞， 从而获知菌株间细胞成分的差异。 利用连续密度梯度离心法分离酿酒酵母同步化细胞， 分别对六个酵母菌株的同步化单细胞进行拉曼信号收集， 并结合主成分分析(PCA)、 辨别函数分析(DFA)两种多元统计分析光谱差异。 结果表明， 细胞的拉曼光谱表征其物质的基本组成与结构， 六个菌株的拉曼光谱比较发现菌株间细胞的蛋白质、 脂类的差异较大， 而核酸类物质相差较小。 六个菌株的拉曼光谱经多元统计分析可以在一定程度得到区分， 辨别函数分析结果显示影响菌株间光谱差异最大共有14个峰: 706， 862， 918， 997， 1 073， 1 127， 1 269， 1 291， 1 305， 1 429， 1 465， 1 591， 1 602 和1 652 cm-1， 其中10个峰归属为蛋白质， 3个峰归属为脂类， 1个峰归属为核酸。 根据DFA载荷， 从1 340个谱线中提取出上述的14个谱峰进行新的DFA结果， 与前面的结果是一致的。 此方法能在单个活体细胞中进行， 无需复杂前处理， 能较好地研究遗传本质相差较小的酿酒酵母菌株间的成分差别。

应用激光镊子拉曼光谱技术(LTRS)测定19株芽孢杆菌的单个细菌芽孢吡啶二羧酸(DPA)浓度, 并验证了系统的重现性。 一束30 mW, 785 nm的近红外激光导入倒置显微镜, 形成光镊, 随机俘获水溶液中的单个芽孢, 同时收集其拉曼光谱信号。 细菌芽孢的DPA是以与钙离子形成的鳌合物(Ca-DPA)形式存在, 收集到的芽孢拉曼光谱信号反映的是Ca-DPA信息, 选用信号最强、 与Ca-DPA浓度成线性关系的1 017 cm-1作为其定量的谱峰。 通过1 017 cm-1的峰强, 推算出Ca-DPA的浓度。 结果显示, 单个芽孢的拉曼光谱能够很好地反映出单个芽孢的特征信息, 不同种、 同种不同菌株之间的芽孢的DPA浓度有所不同, 同一菌株的不同芽孢个体之间DPA浓度也存在差异。 该方法不需要复杂的分离、 纯化过程, 可在水溶液中直接俘获单个芽孢并收集其拉曼光谱信号, 便可得到单个芽孢的信息, 读出DPA的浓度水平。