microRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为19~23个核苷酸的非编码RNA, 通过影响mRNA的稳定性和翻译, 来参与基因表达的转录后调控。生物信息学分析表明该基因在各个物种中高度保守。为了阐明该基因在肠道发育中的作用, 本文利用Cloning free CRISPR/Cas9基因编辑技术构建miR-196a-1基因敲除的斑马鱼品系。首先通过分析软件筛选出斑马鱼miR-196a-1基因的两个敲除位点, 两个敲除位点相隔132 bp, 利用PCR技术扩增miR-196a-1的向导DNA, 再以向导DNA为模板转录得到miR-196a-1的sgRNA, 将miR-196a-1基因的sgRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼胚胎1细胞期胚胎中。斑马鱼胚胎发育到36 hpf后进行基因编辑的有效性检测, 研究结果显示,miR-196a-1基因出现102 bp碱基的缺失, 表明CRISPR/Cas9系统对miR-196a-1基因的敲除有效。对其F0代、F1代、F2代进行筛选, 成功获得斑马鱼miR-196a-1基因敲除品系, 为研究miR-196a-1在肠道发育中的作用奠定了基础。

利用以阳离子共轭聚合物为能量供体的荧光共振能量转移（FRET）策略和滚环扩增放大技术, 建立了一种新型的microRNA（miRNA）检测方法。 阳离子共轭聚合物采用聚［（9,9-双（6’-N,N,N-三乙基铵）己基）亚芴基亚苯基二溴化物］（PFP）。 PFP是一种由大量吸光单元共轭而成的阳离子聚合物, 具有独特的光捕获和荧光增强性能, 可以和带有负电荷的DNA通过静电作用相互结合。 SG是一种能够结合于所有双链DNA双螺旋小沟区域的染料, 其在游离状态下, 荧光微弱, 但一旦与双链DNA结合后, 荧光会大大的增强。 首先, 设计了一条可与目标分子特异性杂交的锁式探针和与RCA产物序列互补的DNA链。 当体系中存在miRNA时, 在T4 DNA连接酶作用下, 锁式探针连接成环； 随后, 在phi29 DNA聚合酶和dNTPs共同作用下, 在miRNA的3’端滚环扩增出一条与锁式探针序列互补的长单链DNA, 所得产物与互补DNA链杂交形成双链DNA（dsDNA）。 此时SG作为FRET受体掺入其中, 形成SG-dsDNA共同体。 随后, SG-dsDNA与PFP因静电相互作用而紧密接近, 由于PFP的发射光谱与SG的激发光谱有重叠, 因此二者之间可以发生FRET现象。 反之, 当体系中不存在miRNA时, 挂锁探针则无法连接成环, 阻止了扩增反应的进行及其产物与互补DNA链的杂交反应。 加入SG后, 由于SG与单链DNA的结合能力很弱, SG则游离于溶液中, 不会与PFP发生有效的FRET。 因此目标分子的浓度与体系的FRET效率直接相关。 以let 7a作为待测miRNA分子, 在0.05～5 nmol·L-1的范围内, let 7a的浓度与从反应体系测得的FRET效率（I520/I423）成正比。 同时以无PFP参加的检测方案作为对比实验, 证明了PFP确实具有提高灵敏度的作用。 另外, 以四种同族miRNA分子及两种其他miRNA分子作为干扰物质对方法的特异性进行了考察, 发现除了两种与目标分子序列高度相似的物质存在干扰外, 其他物质几乎不产生信号。 利用该方法对细胞总RNA提取液中let 7a的含量及其加标含量进行了检测, 测量所得回收率基本令人满意。 所建立的方案不需要荧光标记探针, 有效降低了检测成本, 简化了操作步骤, 在与miRNA相关的疾病诊断领域具有一定的应用前景。

为了实现MicroRNA的快速检测, 设计了一种便携式MicroRNA快速检测仪.基于等温滚环扩增技术, 采用光电检测方法, 检测标志物受激发出的荧光光强, 建立特征荧光分析检测系统.通过改变激发光强度、MicroRNA试剂浓度等参量, 验证了该仪器可测量的MicroRNA的浓度范围为0.01~0.1 μmol, 可检测出的最低检出限为7个拷贝数, MicroRNA浓度与荧光信号强度之间为线性关系(R2=0.999 1).

microRNAs(miRNAs)是一类普遍存在于真核细胞的非编码小分子RNA, 通常在转录后水平抑制靶基因的表达。miRNA表达失调与许多疾病相关, 如II型糖尿病(T2D)。II型糖尿病是一种复杂的疾病, 显著特征是高血糖。近年来的研究表明, miRNA在II型糖尿病的发生发展中扮演着不同的角色。本研究通过miRNA微阵列芯片和实时荧光定量PCR的方法, 发现hsa-miR-1249 和hsa-miR-486-5p在II型糖尿病患者血浆中较之于正常对照组表达显著降低, 显示了hsa-miR-1249和hsa-miR-486-5p可能在II型糖尿病的发病过程中起着重要的作用。本研究揭示了hsa-miR-1249和hsa-miR-486-5p有可能成为II型糖尿病的新的诊断标志物和治疗靶标。

肿瘤干细胞(Cancer stem cells, CSCs)是肿瘤组织中一小部分具有自我更新和致瘤性的细胞, 具有特殊的耐药机制, 与肿瘤的复发和治疗失败关系密切。微小RNA(microRNAs, miRNAs)是一类长度约为19~25个核苷酸的内源性非编码单链RNA, 能够通过调控相关靶基因的表达, 参与调控肿瘤干细胞增殖、凋亡、上皮-间质转化等重要的生命过程, 引起CSCs对化疗药物产生原发性多药耐药性。本论文就miRNAs在调控CSCs多药耐药性方面的研究进展作一综述。

目的: 明确miR-223在胶质瘤细胞中对PAX6基因3′-UTR的靶向调控作用。方法: 生物信息学软件预测PAX6基因3′-UTR的靶向miRNAs; 分别构建野生型和突变型PAX6基因3′-UTR双荧光素酶报告基因质粒; 共转染miR-223 mimics与野生型和突变型双荧光素酶报告基因质粒于U251细胞中, 双荧光素酶检测系统测定荧光素酶活性。结果: 生物信息学软件预测显示PAX6可能是miR-223的靶基因; 与转染野生型PAX6 3′-UTR-psiCHECKTM-2质粒组和转染突变型PAX6 Mut 3′-UTR-psiCHECKTM-2质粒组相比, miR-223 mimics能明显降低野生型荧光素酶质粒活性。结论: miR-223能够靶向负性调控PAX6基因3′-UTR的活性。

逆境胁迫严重影响着全世界范围内的作物产量。为减少逆境胁迫损伤, 植物在长期的进化过程中形成了多级别（转录、转录后和翻译、翻译后）的基因表达调控应答机制。最近研究发现, 内源microRNA（miRNA）在植物逆境胁迫应答中具有重要的调节作用。在逆境胁迫发生时, 一些miRNA会表达上调, 而另一些miRNA会表达下调; miRNA正是通过下调胁迫应答过程的负调节子靶基因和上调胁迫应答过程中的正调节子靶基因, 来执行生理调控功能。通过综述miRNA在植物逆境应答中的作用, 以期全面的了解逆境胁迫调控网络。