紫苏［Perilla frutescens(L.)Britt.］是一种新型油料经济作物。转录因子WRI1(WRINKLED1)参与调控植物油脂合成积累。为探究紫苏PfWRI1在油脂合成积累及胁迫响应过程中的分子调控机制, 通过分子克隆技术分离得到PfWRI1的完整编码区, 利用生物信息学分析工具和半定量PCR(sqRT-PCR)及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对序列特征及表达水平等进行分析。结果显示: PfWRI1转录因子属于AP2(APETALA2)超家族, 包含2个AP2保守结构域; 亚细胞定位预测分析显示, PfWRI1转录因子定位于细胞核; 无规则卷曲和α-螺旋是PfWRI1蛋白二级结构中的主要结构元件; 系统进化分析表明, PfWRI1与芝麻和油梨WRI1的亲缘关系最近; 互作蛋白预测表明, PfWRI1蛋白可能与LEC1(LEAFYCOTYLEDON1)、FATA(fatty acyl-acyl carrier protien thioesterase)、FATB和PDAT(phospholipids:diacylglycerol acyltransferase)等存在互作关系; PfWRI1在紫苏的不同组织中均有表达, 随种子成熟其表达量呈现先升高后降低的模式, 且在发育中后期(开花后30 d)种子的表达量最高, 表明PfWRI1可能在紫苏种子油脂合成中具有调控作用; 紫苏幼苗经过低温胁迫后, PfWRI1的表达量在胁迫12 h后显著上调, 说明PfWRI1可能参与紫苏幼苗冷胁迫响应。这些结果为进一步研究PfWRI1在紫苏油脂合成积累和胁迫响应中的分子机制及功能奠定了基础, 为紫苏和其他油料作物的遗传改良和新品种选育提供了理论依据。

油体钙蛋白(caleosin)是参与油体合成的一类蛋白质。本研究从紫苏转录组数据库中筛选获得caleosin的PfClo1和PfClo2两个基因片段, 通过表达特性分析发现, PfClo2基因在紫苏不同组织中几乎不表达, 故选定PfClo1基因进行克隆及实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析, 探究基因PfClo1在紫苏不同品种中的表达特性及对干旱胁迫的响应。紫苏caleosin的PfClo1基因序列分析结果表明, PfClo1基因的开放阅读框(ORF)序列为609 bp, 共编码202个氨基酸, 理论等电点为5.19, 亲水性系数为0.678, PSORT软件预测PfClo1蛋白定位于细胞质; BLAST同源序列比对表明, PfClo1与丹参和芝麻的caleosin序列相似性较高, 属于典型的caleosin家族成员; qRT-PCR分析结果表明, PfClo1基因在‘晋紫苏1号’的花和种子中均有表达, 且在开花后30 d的种子中表达量最高; 通过分析不同紫苏品种的差异表达发现, PfClo1基因的表达与紫苏油脂合成存在一定的正相关关系; 用20%聚乙二醇(PEG)对‘晋紫苏1号’幼苗进行干旱胁迫处理后发现, PfClo1基因在胁迫处理12 h时表达量达到最高, 为对照的6.78倍, 推测该基因可能在紫苏干旱胁迫诱导中发挥调控作用。该研究结果为深入探究PfClo1基因在紫苏种子发育及干旱胁迫应答中的功能提供了理论依据。

为优化紫苏种子中总黄酮的提取方法, 采用乙醇加热提取和超声波辅助提取, 对提取液浓度、提取时间、提取温度开展了研究; 并探究了不同地区的紫苏种子中总黄酮的含量, 同时采用高效液相色谱法(HPLC)测定了不同地区的紫苏种子中芦丁和木犀草素的含量。试验结果表明: 在用80%的乙醇溶液提取紫苏种子中的总黄酮时, 温度控制在70℃, 浸提120 min, 提取率最高, 可达4.39%; 同等条件下用超声波辅助提取时, 浸提90 min提取率最高, 可达4.27%; 超声波浸提法简便、快速、准确度较高, 但不适宜长时提取; 参试的4个不同地区的紫苏种子总黄酮含量差异极显著(F=17.592 0, P=0.000 7), 宁夏中宁总黄酮含量是陕西蓝田的1.73倍; 而且不同地区的紫苏种子中芦丁和木犀草素的含量不同, 宁夏中宁芦丁含量最高, 贵州都匀木犀草素含量最高。

甘油三磷酸酰基转移酶(GPAT)是三酰甘油(TAG)合成过程中的关键酶。本研究从油料作物紫苏中筛选鉴定得到甘油三磷酸酰基转移酶基因Pfgpat9, 并揭示其编码蛋白特征及基因功能。从紫苏转录组数据库中筛选获得gpat9基因片段, 以优选品种‘晋紫苏1号’为材料, 通过RT-PCR技术克隆获得该基因的开放阅读框(ORF)全长序列, 命名为Pfgpat9; 利用实时荧光定量PCR方法分析Pfgpat9基因在紫苏根、茎、叶、花及不同发育时期种子(开花后10、20、30、40 d)中的组织表达特性; 通过双酶切将紫苏Pfgpat9基因完整的ORF序列连接到酵母表达载体pYES2.0上, 将重组质粒转化至野生型酵母菌株INVSc1和缺陷型酵母gat1, 并验证该基因的功能。结果显示: 紫苏Pfgpat9基因ORF为1 116 bp, 共编码371个氨基酸, 理论等电点pI为8.96, 不稳定系数为46.67, 亲水性系数为-0.108, 是一种亲水性不稳定蛋白。紫苏Pfgpat9基因具有典型的GPAT9功能结构域, 包含3个典型的跨膜螺旋区; 多序列比对分析表明, 紫苏PfGPAT9蛋白与油橄榄、茶树和向日葵GPAT9蛋白的亲缘关系较近; qRT-PCR分析显示, Pfgpat9基因在紫苏不同组织中均表达, 在种子发育不同时期表达量呈先升高后降低趋势, 在开花后20 d表达量达到最高; 酵母转化结果表明, 转Pfgpat9基因野生型酵母和转Pfgpat9基因缺陷型酵母总脂含量均提高, 且C16∶0、C16∶1含量均有所提高。研究表明, Pfgpat9基因在紫苏种子油脂合成积累过程中发挥重要作用, 这为进一步通过基因工程及转基因技术改良紫苏品质提供了新的方向。

为加快紫苏优质育种进程, 采用近红外光谱(NIRS)技术, 结合线性偏最小二乘法(PLS), 以250份全国范围内收集的紫苏资源为研究材料, 分别较好的建立其种子中含油量, 棕榈酸(C16∶0), 硬脂酸(C18∶0), 油酸(C18∶1), 亚油酸(C18∶2), a-亚麻酸(C18∶3)含量的六个近红外光谱校正模型。 结果显示, 六个模型的校正决定系数(RSQ1)分别为: 0.98, 0.91, 0.92, 0.92, 0.85, 0.93; 交叉验证决定系数(1-VR)分别为: 0.97, 0.89, 0.89, 0.91, 0.85和0.91; 外部验证相关系数(RSQ)分别为: 0.98, 0.91, 0.89, 0.90, 0.80和0.89, 且定标标准误差(SEC)分别为0.99, 0.21, 0.1, 0.94, 0.81, 0.92; 交叉验证标准误差(SECV)分别为1.16, 0.23, 0.11, 1.05, 0.92, 1.02和预测标准误差(SEP)分别为0.97, 0.21, 0.11, 1.12, 0.99, 1.14。 结果表明, 此六个校正模型质量均较高。 这些首次建立的快速无损的近红外分析模型, 可为紫苏资源开发提供指导, 对紫苏油分品质育种具有重要意义。