为揭示羊驼毛色形成机理以及毛用性状改良奠定基础, 选用羊驼作为试验动物群体, 以酪氨酸酶作为影响羊驼毛色性状的候选基因, 采用荧光定量PCR技术、免疫组织化学、免疫印迹等生物学方法从基因与蛋白方面分析了羊驼酪氨酸酶(tyrosinase, TYR)在不同毛色个体的表达量。荧光定量PCR结果显示TYR基因在棕色个体中的mRNA表达量高于白色个体中。免疫印迹实验与免疫组化实验均表明TYR蛋白在棕色个体中的蛋白表达量高于在白色个体中的蛋白表达量。综上, 毛色表型与酪氨酸酶的表达量存在相关性, TYR参与调控了毛色色素沉着过程。

目的: 探索不同剂量的L-酪氨酸对羊驼黑素细胞增殖以及酪氨酸酶mRNA表达的影响。方法: 体外培养正常羊驼皮肤黑素细胞, 显微镜下观察不同剂量的L-酪氨酸(100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L、400 μmol/L)对羊驼皮肤黑素细胞增殖的影响, 利用实时荧光定量PCR技术分析不同剂量L-酪氨酸对酪氨酸酶mRNA的表达量的影响。结果: 研究结果显示: 在培养的黑素细胞中添加了不同剂量L-酪氨酸3 d后, 镜检观察, 黑素细胞数量相比较空白对照组有所减少, 酪氨酸酶mRNA表达量增加且显著高于对照组(P<0.05), 在200 μmol/L时, 酪氨酸酶mRNA表达量达到最高峰值。结论: L-酪氨酸能诱导羊驼皮肤黑素细胞酪氨酸酶mRNA表达量增高。

用RT-PCR法获得了黄色羊驼皮肤的CDK5完整CDS区, 其长度为891 bp, 与其他哺乳动物相比, 高度保守。通过对其结构域分析, 发现羊驼CDK5编码区在第10-203位氨基酸间含有多个激活位点如ATP结合位点和P25底物结合位点。第1-9位氨基酸和第204-292位氨基酸为两个非活性部位, 其中在第204-292位氨基酸中, 亮氨酸排列与亮氨酸拉链结构相似, 而且位于羊驼CDK5的C-端, 可能是与基因转录调控有关

从羊驼皮肤cDNA文库中筛选到RPL34的克隆, 经PCR鉴定并测序得知: 一种克隆的大小为270 bp（命名为RPL34 I）, 另一种克隆的大小为470 bp（命名为RPL34 II）。序列分析发现, RPL34 I和II在核苷酸水平上, 5’UTR区不具有同源性, 3’UTR区具有同源性; 在氨基酸水平上, 部分具有高度同源性; 分子进化树分析表明二者具有不同的进化速率。此外, RPL34 I和II对应于不同的转录本。通过以上结果分析, 认为RPL34 I和RPL34 II二者同时在羊驼皮肤中表达, 可能是RPL34的两个剪接体, 发挥不同的生物学功能。

为研究羊驼毛的特性并评价羊驼的生产性能,观察了羊驼皮肤和毛的显微结构和超微结构.结果表明:皮肤中皮脂腺很少,这决定了羊驼毛易清洗;毛囊由初级毛囊和大部分复合毛囊组成,因此大部分羊驼毛很细;羊驼毛的髓质比例小于皮质所占比例,而且白毛的髓质与皮质的比例大于有色毛,这决定了羊驼毛轻而具有好的保暖性,且白毛重量轻于有色毛;羊驼毛的皮质细胞具有双层结构,上皮细胞有5层,皮质周围有内、外上皮,这些结构可能使毛避免损伤,并可使黑色素颗粒避免丢失以维持其自然色;羊驼毛的鳞片呈锯齿状并形成裂痕,具有疏水性,因此羊驼毛可以防水.所有这些特点决定了羊驼毛在毛纺工业中是理想的原料.

为研究羊驼显性白毛调控基因的结构特点及体外表达产物的生物活性,利用RT-PCR技术,首次从羊驼皮肤组织中扩增出羊驼KIT基因exon10-14 cDNA编码序列.结果表明:羊驼KIT基因exon10-14 cDNA长414bp,包括30 bp的exon10、127 bp的exon11、125 bp的exon12、91 bp的exon13和4l bp的exon14(全长151 bp),编码含138个氨基酸残基的蛋白;羊驼与牛、羊、猪、人、马等相比,核苷酸的同源性分别为94%、93%、93%、92%、92%,氨基酸的同源性均大于97%.构建了原核表达载体pET-32a(+)-KIT,转化大肠杆菌DH5α,在异丙基硫代半乳糖苷诱导下表达KIT蛋白.结果表明:羊驼KIT基因在大肠杆菌中进行了高效特异性融合表达,融合蛋白分子量约为36 kD,目的蛋白约占菌体总蛋白的20%.

应用RAPD技术对羊驼群体进行亲缘关系检测.在所采用的40条随机引物中筛选出10条,优化了RAPD的反应条件,确立了适合于羊驼基因组RAPD分析的最佳反应体系和反应程序.计算出个体间之间的带纹相似系数及遗传距离指数,带纹相似系数位于0.3901～0.7851之间,平均为0.5374;彼此间的遗传距离最小为0.2149,最大为0.6099,平均为0.4626,并绘制出个体间亲缘关系树状聚类图.结果显示羊驼种群内遗传基础广泛,证明其个体间的血缘关系较远,这将有利于羊驼种群的正常生长、发育、繁殖和快速扩群.

采用原核表达载体pet-32-a+构建了羊驼皮肤组织cDNA文库.双链cDNA采用Universal RiboClone cDNA Synthesis System合成,并经过琼脂糖分级胶回收,去除了小于400 bp的片断;通过酶切载体的去磷酸化和插入片断的磷酸化,提高了重组率,蓝白斑筛选结果全部为阳性;库扩增后检测容量达2.25×107.随机挑取阳性克隆进行单引物测序分析,七个测序样品中获得两个与毛发生长相关的EST(expression sequence tag),分别为S100钙离子结合蛋白A3基因(S100 calcium binding protein A3,S100A3)的部分序列和高硫角蛋白关联蛋白基因(high sulfur keratin-associated protein,KRTAP3-3)的部分序列,说明所构建的文库具有较高的代表性.

通过氯仿/异戊醇法制备羊驼血液基因组DNA,采用PCR方法首次扩增出羊驼催乳素受体基因(prolactin receptor gene,PRLR)exon8-exon9序列(GenBank登录号为DQl98164),该片段长度为622 bp.通过NCBIblast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)比较,结果表明:该序列包括exon8的82 bp、intron 8全序列472 bp和exon9的68 bp.同源性比较发现,羊驼PRLR基因exon8和exon9核苷酸序列与其它哺乳动物的相应区域的同源性特高,均≥92%;同时还发现羊驼exoN8引物后第19个碱基为G,而其它哺乳动物(猪除外)均为A,猪则是在羊驼exon8引物后的第34个碱基处由G变为A,通过推导氨基酸序列分析发现,这种单碱基的突变使得羊驼与其它哺乳动物相比,该处的氨基酸由亮氨酸取代了异亮氨酸;在羊驼exon9引物前第22个碱基处也发生了A-G碱基替换现象,但这个碱基的突变发生在密码子的第3个碱基上,编码的氨基酸均为脯氨酸.在这些动物中只有羊驼为单胎动物,羊驼exon8核苷酸序列中A-G的碱基替换并引起编码氨基酸序列发生改变是否与羊驼繁殖性能有关还有待进一步研究.

实验通过克隆分析羊驼催乳素基因的部分序列,对羊驼催乳素基因的结构和功能进行初步探索和揭示.从GeneBank中已报到的脊椎动物催乳素基因保守区设计一对引物,采用Trizol法提取羊驼胎盘总RNA,利用RT-PCR技术扩增出长度约为510 bp的片断.测序后在NCBI工作平台中进行BLASTn同源性比较,得出结论:羊驼催乳素基因与已登录的哺乳动物催乳素基因同源性均超过85%,最高达97%.借助DNAstar分子生物学分析软件绘制了相关动物的遗传进化图,并对羊驼的种属地位进行了进一步验证.