1 湖南省兽药饲料监察所, 长沙 410006
2 湖南农业大学动物医学院, 长沙 410128湖南省兽药工程技术研究中心, 长沙 410128
3 湖南农业大学动物医学院, 长沙 410128
血管生成素 4(ANG4)是一种新型抗菌肽蛋白, 具有抗菌、抗炎、血管生成、调节机体免疫反应等多种生物学功能, 在机体先天免疫过程中发挥重要的作用。 ANG4在新生小鼠肠道的表达受到多种因素的调节, 如细菌信号和发育过程等。本试验选取细菌细胞壁表面分子的类似物壳寡糖( COS)作为诱导物, 探究其对小鼠肠道 ANG4表达和对肠道形态的影响。实时荧光定量聚合酶链式反应( qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹( Western blot)分析表明, COS能增加小鼠肠道 ANG4 mRNA及 ANG4蛋白的表达；形态学观察结果显示, COS使小肠绒毛高度明显增加, 平均隐窝深度均有降低, V/C值增加, 表明 COS可通过诱导 ANG4等抗菌蛋白的表达, 或通过其杀菌和免疫调节作用而不同程度地提高小肠黏膜的完整性。研究结果为 COS以及 ANG4在仔猪肠道疾病防治的应用提供了理
抗菌蛋白 实时荧光定量 PCR 蛋白质免疫印迹 ANG4 ANG4 COS COS AMPs qRT-PCR Western blot
食品安全监测与预警湖南省重点实验室, 湖南省食品质量监督检验研究院, 长沙 410117
为建立一种特异性强、灵敏度高、重复性好的非洲猪瘟病毒微滴数字PCR检测方法, 本研究根据非洲猪瘟病毒核酸的2段保守序列(VP72和K205基因)设计合成了3对引物和探针, 摸索其反应条件, 优化方法, 比较方法的线性、特异性、灵敏性和重复性。结果发现, 这3对引物和探针的非洲猪瘟病毒方法检出限均小于6拷贝数/反应, 在10~106拷贝数/反应之间均呈良好的线性关系, 定量范围内的检测变异系数均低于15%, 且不与猪常见的2种病毒发生交叉反应, 适用于猪肉及其制品中非洲猪瘟病毒的检测, 有利于在源头、食品加工、食品销售等各个环节加强对生鲜猪肉及各类猪肉制品中非洲猪瘟病毒的检测, 切实降低潜在风险。
非洲猪瘟 病毒 微滴数字PCR 实时荧光定量PCR African swine fever virus droplet digital PCR quantitative real-time PCR
1 湖南农业大学动物医学院， 湖南 长沙 410128
2 湖南省兽药工程技术研究中心， 湖南 长沙 410128
血管生成素4(ANG4)是一种新型的抗菌肽，主要在哺乳动物的肠道组织表达，具有抗菌和促血管生成等功能，在机体对病原体的免疫过程和血管生成过程中发挥着重要的作用。鉴于该蛋白具有多种功能，ANG4在新生断奶仔猪肠道疾病防治方面具有非常广阔的前景。为了了解ANG4在仔猪肠道的表达特点，我们通过蛋白质免疫印迹、荧光定量PCR和免疫组化分析及其在肠道表达的细胞定位，分别确定了仔猪肠道内ANG4的mRNA、蛋白质表达水平以及在肠道表达的细胞定位。结果显示，ANG4的mRNA和蛋白质在仔猪肠道不同部位的变化趋势大致相同，除mRNA 水平在断奶后有一个明显下降外，mRNA和蛋白质表达水平呈现随着周龄的增加而升高的趋势。ANG4蛋白的表达基本都集中于小肠绒毛，腺窝处也有少量表达，主要的表达细胞为肠上皮细胞以及潘氏细胞。
荧光定量PCR 蛋白质免疫印迹 免疫组化 ANG4 angiogenin4 real-time PCR western blot immunohistochemistry
1 湖南农业大学动物医学院, 湖南 长沙410128
2 湖南省兽药工程技术研究中心, 湖南 长沙410128
肠道抗菌肽(AMPs)由肠粘膜上皮细胞合成或分泌的一类防御性肽类活性物质, 在肠道的先天性免疫过程中具有重要的作用。猪肠粘膜上皮细胞可分泌β-防御素2(BD2)、β-防御素3(BD3)、RegIII γ、溶菌酶(LYS)和血管生成素4(ANG4)等多种抗菌肽。文章通过荧光定量PCR(real-time Q-PCR)分析新生仔猪RegIIIγ、ANG4、BD2、BD3和溶菌酶等抗菌蛋白在十二指肠、空肠、回肠内不同发育阶段的mRNA的表达变化。结果表明, 所有抗菌肽的mRNA水平在出生后均逐渐升高, 但在断奶后的表达水平降低, 随后又显著升高。此外在肠道中最主要的抗菌肽是溶菌酶和RegIIIγ, 意味着这两种抗菌肽在肠粘膜的先天免疫中具有十分重要的作用。
抗菌肽 血管生成素4 β-防御素2 β-防御素3 溶菌酶 荧光定量PCR antibacterial peptide RegIII γ RegIIIγ angiopoietin 4 β-defensin 2 β-defensin 3 lysozyme real-time PCR
湖南农业大学动物医学院, 湖南 长沙 410128
RegIIIγ是一种新型的抗菌肽, 主要在哺乳动物的肠道和皮肤表达, 具有抗菌、抗炎、调节免疫反应和促进细胞增殖等生理功能。为了解猪RegIIIγ在肠道的表达特点, 我们通过荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹和免疫组化分别确定了猪RegIIIγ mRNA和蛋白在仔猪肠道的表达水平以及在肠道表达的细胞类型。结果表明RegIIIγ mRNA和蛋白质在十二指肠、空肠和回肠三个部位的表达水平无明显差异; 除mRNA水平在断奶后有一个明显下降外, mRNA和蛋白质表达水平呈现随着周龄的增加而升高的趋势。免疫组化分析表明RegIIIγ蛋白主要在肠粘膜吸收性上皮细胞和Paneth细胞内表达。
荧光定量PCR 蛋白质免疫印迹 免疫组化 RegIIIγ RegIIIγ real-time PCR western blot immunohistochemistry
1 中国科学院合肥物质科学研究院应用技术研究所, 安徽省生物医学光学仪器工程技术研究中心, 安徽 合肥 230031
2 皖江新兴产业技术发展中心, 安徽 铜陵 244000
研究高通量微流控荧光定量聚合酶链反应(PCR)激发光非均匀性问题对提高DNA浓度 定量结果的精度具有重要意义。 根据荧光定量PCR的原理,分析了激发光非均匀性对循环阈值(Ct)测量精度的影响,给出了激发光非均 匀性引起Ct值测量偏差的表达式,确定了激发光强度标准偏差应小于11.56%的要求。根据微流控芯片结 构特点及激发光均匀性要求,设计了基于光棒的匀光光路用于解决激发光照度非均匀性问题。模拟及实 验所得到的激发光照度的相对标准偏差分别为3.10%、6.01%,二者均小于11.56%。所设计匀光光路能够 满足高通量微流控荧光定量PCR的要求。
医用光学与生物技术 均匀照明 光学设计 微流控芯片 荧光定量PCR medical optics and biotechnology uniform illumination optical design microfluidic chip qPCR
1 山西农业大学信息学院, 山西 太谷 030800
2 山西农业大学动物科技学院, 山西 太谷 030800
为探讨神经生长因子(Nerve growth factor, NGF)在雄鸡睾丸组织中的表达情况。分别取20 w、24 w、28 w、35 w龄雄鸡睾丸组织, 一部分经冻存处理后采用Trizol试剂提取Total RNA。根据GenBank中已公布的原鸡NGF基因序列, 利用Primer 5.0设计合成特异性引物, 通过两步法RT-PCR扩增出NGF基因片段, 然后利用实时荧光定量PCR以β-actin为内参基因进行相对定量分析。另一部分经冻存处理后用RIPA组织裂解液提取总蛋白进行Western blot分析。结果显示两步法RT-PCR扩增出的NGF基因片段经电泳检测为219 bp, 符合预期片段大小, 与GenBank中登录的鸡NGF基因比对, 同源性达99%; NGF基因在不同周龄雄鸡睾丸组织中的mRNA表达水平表现为: 性成熟发育期(20 w-28 w)雄鸡睾丸组织NGF mRNA的表达量随鸡龄的增加呈上升趋势, 且28 w达到高峰, 成年期(35 w)有所下降。Western blot检测到NGF的蛋白表达量随各发育阶段呈增加趋势, 在20 w龄前, 蛋白表达量处于较低水平, 在进入睾丸迅速发育期 (20 w-28 w) 后, 表达量大幅度增加, 在35 w基本达到峰值。提示 NGF mRNA 的表达随着睾丸组织的发生、发育呈现一定的变化规律, 且NGF在睾丸组织的发育及精子的发生等阶段起到重要的调节作用, 从而为后续研究NGF在禽类生殖系统中的作用提供一定的理论依据。
神经生长因子 睾丸 雄鸡 发育过程 实时荧光定量 PCR nerve growth factor testis rooster developmental process real-time PCR
华南师范大学生物光子学研究院激光生命科学研究所、暨激光生命科学教育部重点实验室, 广东 广州 510631
针对转基因大豆中普遍含有的35S启动子进行引物设计, 以双链DNA染料SYBR GreenⅠ为荧光标记物, 利用实时荧光定量PCR方法对大豆样品进行检测。该法检测转基因大豆的检测低限为0.005 nmol/L的35S启动子, 线性范围达3个数量级, 可快速区分转基因大豆和非转基因大豆, 具有快速、简便、灵敏、安全、高通量、低成本等优点, 可推广用于转基因植物产品的快速定量检测。
实时荧光定量PCR 转基因大豆 35S启动子 real-time fluorescence quantitative PCR genetically modified soybean 35S promoter
浙江中医药大学生物工程学院, 浙江 杭州 310053
目的: 应用实时荧光PCR检测大鼠脑缺血/再灌注损伤组织中的Caspase-3基因表达变化, 并比较了相对定量与绝对定量分析方法的技术优劣。方法: 相对定量实验中, 以β-actin基因作为内参, 采用Delta-delta Ct法计算目的基因表达变化。而在绝对定量实验中, 构建了含Caspase-3基因的重组质粒, 以该重组质粒作标准品, 构建标准曲线并计算样品组中Caspase-3基因拷贝数。结果: 相对定量数据表明相对于假手术组, Caspase-3基因在模型组中的表达上调了7.52倍, 而在治疗组1和2中分别上调了4.20倍和3.07倍。绝对定量实验结果表明假手术组Caspase-3基因拷贝数为1.42×105 copies/μL, 模型组中该基因为8.06×105 copies/μL, 基因上调了5.68倍, 而治疗组1和2中该基因拷贝数分别为3.83×105 copies/μL和3.59×105 copies/μL, 分别上调了2.71和2.52倍。结论: 两种定量分析方法表明Caspase-3基因在模型组中和治疗组中变化趋势基本一致。绝对定量方法更精确, 但需要标准品, 所花费成本高。而相对定量方法虽然简便, 但需要看家基因作为内参, 存在一定误差, 如何保证目的基因与内参基因扩增效率一致性是关健。
荧光定量PCR 相对定量 绝对定量 脑缺血/再灌注 real-time PCR relative quantification absolute quantification Caspase-3 Caspase-3 cerebral ischem-Reperfusion
山西农业大学动物科技学院, 山西 太谷 030801
目的: 探索不同剂量的L-酪氨酸对羊驼黑素细胞增殖以及酪氨酸酶mRNA表达的影响。方法: 体外培养正常羊驼皮肤黑素细胞, 显微镜下观察不同剂量的L-酪氨酸(100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L、400 μmol/L)对羊驼皮肤黑素细胞增殖的影响, 利用实时荧光定量PCR技术分析不同剂量L-酪氨酸对酪氨酸酶mRNA的表达量的影响。结果: 研究结果显示: 在培养的黑素细胞中添加了不同剂量L-酪氨酸3 d后, 镜检观察, 黑素细胞数量相比较空白对照组有所减少, 酪氨酸酶mRNA表达量增加且显著高于对照组(P<0.05), 在200 μmol/L时, 酪氨酸酶mRNA表达量达到最高峰值。结论: L-酪氨酸能诱导羊驼皮肤黑素细胞酪氨酸酶mRNA表达量增高。
L-酪氨酸 酪氨酸酶 羊驼 皮肤 黑素细胞 荧光定量PCR L-tyr tyrosinase Alpaca skin melanocytes QRT-PCR
