为建立一种特异性强、灵敏度高、重复性好的非洲猪瘟病毒微滴数字PCR检测方法, 本研究根据非洲猪瘟病毒核酸的2段保守序列(VP72和K205基因)设计合成了3对引物和探针, 摸索其反应条件, 优化方法, 比较方法的线性、特异性、灵敏性和重复性。结果发现, 这3对引物和探针的非洲猪瘟病毒方法检出限均小于6拷贝数/反应, 在10~106拷贝数/反应之间均呈良好的线性关系, 定量范围内的检测变异系数均低于15%, 且不与猪常见的2种病毒发生交叉反应, 适用于猪肉及其制品中非洲猪瘟病毒的检测, 有利于在源头、食品加工、食品销售等各个环节加强对生鲜猪肉及各类猪肉制品中非洲猪瘟病毒的检测, 切实降低潜在风险。

血管生成素4(ANG4)是一种新型的抗菌肽，主要在哺乳动物的肠道组织表达，具有抗菌和促血管生成等功能，在机体对病原体的免疫过程和血管生成过程中发挥着重要的作用。鉴于该蛋白具有多种功能，ANG4在新生断奶仔猪肠道疾病防治方面具有非常广阔的前景。为了了解ANG4在仔猪肠道的表达特点，我们通过蛋白质免疫印迹、荧光定量PCR和免疫组化分析及其在肠道表达的细胞定位，分别确定了仔猪肠道内ANG4的mRNA、蛋白质表达水平以及在肠道表达的细胞定位。结果显示，ANG4的mRNA和蛋白质在仔猪肠道不同部位的变化趋势大致相同，除mRNA 水平在断奶后有一个明显下降外，mRNA和蛋白质表达水平呈现随着周龄的增加而升高的趋势。ANG4蛋白的表达基本都集中于小肠绒毛，腺窝处也有少量表达，主要的表达细胞为肠上皮细胞以及潘氏细胞。

肠道抗菌肽(AMPs)由肠粘膜上皮细胞合成或分泌的一类防御性肽类活性物质, 在肠道的先天性免疫过程中具有重要的作用。猪肠粘膜上皮细胞可分泌β-防御素2(BD2)、β-防御素3(BD3)、RegIII γ、溶菌酶(LYS)和血管生成素4(ANG4)等多种抗菌肽。文章通过荧光定量PCR(real-time Q-PCR)分析新生仔猪RegIIIγ、ANG4、BD2、BD3和溶菌酶等抗菌蛋白在十二指肠、空肠、回肠内不同发育阶段的mRNA的表达变化。结果表明, 所有抗菌肽的mRNA水平在出生后均逐渐升高, 但在断奶后的表达水平降低, 随后又显著升高。此外在肠道中最主要的抗菌肽是溶菌酶和RegIIIγ, 意味着这两种抗菌肽在肠粘膜的先天免疫中具有十分重要的作用。

RegIIIγ是一种新型的抗菌肽, 主要在哺乳动物的肠道和皮肤表达, 具有抗菌、抗炎、调节免疫反应和促进细胞增殖等生理功能。为了解猪RegIIIγ在肠道的表达特点, 我们通过荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹和免疫组化分别确定了猪RegIIIγ mRNA和蛋白在仔猪肠道的表达水平以及在肠道表达的细胞类型。结果表明RegIIIγ mRNA和蛋白质在十二指肠、空肠和回肠三个部位的表达水平无明显差异; 除mRNA水平在断奶后有一个明显下降外, mRNA和蛋白质表达水平呈现随着周龄的增加而升高的趋势。免疫组化分析表明RegIIIγ蛋白主要在肠粘膜吸收性上皮细胞和Paneth细胞内表达。

为筛选生物钟核心基因per1表达定量中的相对稳定性最好的内参基因, 本研究取翘嘴鳜成鱼心脏、肝脏、肾脏、脑、红肌、白肌、肠、眼和脾等九个组织为研究对象, 选取GAPDH、18S rRNA、β-actin、rps29、RPL13a、B2M和EF1a为内参基因, 采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对per1基因mRNA表达水平进行检测分析。研究结果表明18S rRNA和GAPDH的平均稳定值M最低, 相对表达量最稳定。以18S rRNA和GAPDH为内参基因时分析发现per1基因表达量在肝脏中最高。本研究为在鱼类per1 mRNA表达检测过程中选用稳定的内参基因提供了实验和理论参考。

为探讨神经生长因子(Nerve growth factor, NGF)在雄鸡睾丸组织中的表达情况。分别取20 w、24 w、28 w、35 w龄雄鸡睾丸组织, 一部分经冻存处理后采用Trizol试剂提取Total RNA。根据GenBank中已公布的原鸡NGF基因序列, 利用Primer 5.0设计合成特异性引物, 通过两步法RT-PCR扩增出NGF基因片段, 然后利用实时荧光定量PCR以β-actin为内参基因进行相对定量分析。另一部分经冻存处理后用RIPA组织裂解液提取总蛋白进行Western blot分析。结果显示两步法RT-PCR扩增出的NGF基因片段经电泳检测为219 bp, 符合预期片段大小, 与GenBank中登录的鸡NGF基因比对, 同源性达99%; NGF基因在不同周龄雄鸡睾丸组织中的mRNA表达水平表现为: 性成熟发育期(20 w-28 w)雄鸡睾丸组织NGF mRNA的表达量随鸡龄的增加呈上升趋势, 且28 w达到高峰, 成年期(35 w)有所下降。Western blot检测到NGF的蛋白表达量随各发育阶段呈增加趋势, 在20 w龄前, 蛋白表达量处于较低水平, 在进入睾丸迅速发育期 (20 w-28 w) 后, 表达量大幅度增加, 在35 w基本达到峰值。提示 NGF mRNA 的表达随着睾丸组织的发生、发育呈现一定的变化规律, 且NGF在睾丸组织的发育及精子的发生等阶段起到重要的调节作用, 从而为后续研究NGF在禽类生殖系统中的作用提供一定的理论依据。

目的: 应用实时荧光PCR检测大鼠脑缺血/再灌注损伤组织中的Caspase-3基因表达变化, 并比较了相对定量与绝对定量分析方法的技术优劣。方法: 相对定量实验中, 以β-actin基因作为内参, 采用Delta-delta Ct法计算目的基因表达变化。而在绝对定量实验中, 构建了含Caspase-3基因的重组质粒, 以该重组质粒作标准品, 构建标准曲线并计算样品组中Caspase-3基因拷贝数。结果: 相对定量数据表明相对于假手术组, Caspase-3基因在模型组中的表达上调了7.52倍, 而在治疗组1和2中分别上调了4.20倍和3.07倍。绝对定量实验结果表明假手术组Caspase-3基因拷贝数为1.42×105 copies/μL, 模型组中该基因为8.06×105 copies/μL, 基因上调了5.68倍, 而治疗组1和2中该基因拷贝数分别为3.83×105 copies/μL和3.59×105 copies/μL, 分别上调了2.71和2.52倍。结论: 两种定量分析方法表明Caspase-3基因在模型组中和治疗组中变化趋势基本一致。绝对定量方法更精确, 但需要标准品, 所花费成本高。而相对定量方法虽然简便, 但需要看家基因作为内参, 存在一定误差, 如何保证目的基因与内参基因扩增效率一致性是关健。

实验采用荧光定量PCR方法研究了小鼠在妊娠和泌乳过程中葡萄糖转运载体SLC2A1、SLC2A4与SLC5A1 mRNA的表达规律。结果表明与妊娠期相比, SLC2A1在泌乳期的表达量上调, 泌乳18 d是妊娠18 d表达量的11倍 (P＜0.01); SLC2A4的表达在妊娠和泌乳期无显著差异; SLC5A1的表达量从妊娠至泌乳期呈上升趋势, 泌乳18 d是妊娠18 d表达量的2.5倍(P＜0.01)。SLC2A1是小鼠乳腺泌乳时主要的葡萄糖转运载体, SLC5A1在乳腺葡萄糖的转运过程中也发挥重要作用。